今天要给大家介绍一篇关于LncRNA-XIST表达下调后通过激活miR-335/SOD2/ROS信号通路介导细胞焦亡来抑制非小细胞肺癌的发展的相关研究

文章背景

非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌相关癌症之一，严重危害人类健康。然而，临床上仍没有针对NSCLC治疗的有效疗法，揭示NSCLC发病机制可能解决这一问题。长链非编码RNA（LncRNA）与膀胱癌、胃癌、卵巢癌和NSCLC等多种癌症的发生发展密切相关。例如，LncRNA LINC-PINT通过靶向miR-218-5p/PDCD4来抑制NSCLC进展和LncRNA AWPPH通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进NSCLC细胞增殖。LncRNA-XIST在各种癌症中充当致癌基因并促进NSCLC的发展。例如，LncRNA-XIST促进NSCLC细胞增殖、侵袭和转移。

文章结果

LncRNA-XIST在NSCLC组织和细胞系中的表达水平

作者首先筛选了从临床收集的非小细胞肺癌组织中几种常见的非小细胞肺癌相关的LncRNA 的表达水平（图1A）。结果显示，与邻近的正常组织相比，LncRNA-XIST 在 NSCLC 组织中的过表达最为显着（图 1A），这一结果得到了另外30名NSCLC患者的qPCR 结果的验证（图1B）。此外，通过分析LncRNA-XIST的表达水平与不同临床参数（年龄、性别、TNM 分期、病理类型、吸烟状况和淋巴转移）的相关性，作者发现LncRNA-XIST水平与TNM分期（图1D）和淋巴转移（图1C）呈正相关。Pan-cancer分析结果显示，LncRNA-XIST 水平较高的肺腺癌患者预后相对较差，生存时间较短，尽管没有统计学意义（图1E），进一步的Kaplan-Meier分析证实，LncRNA-XIST表达水平较高的肺腺癌患者的生存率显着更高。低表达的LncRNA-XIST与其对应物相比（图1F）。此外，作者选择了NSCLC细胞系（A549、H1299、SK-MES-1和Calu-3）和人支气管上皮细胞系（HBE）来探索LncRNA-XIST在细胞水平上的异常表达（图1G）。结果表明，A549、H1299和SK-MES-1、Calu-3中LncRNA-XIST的水平明显高于HBE细胞（图1G）。由于与A549细胞相比，LncRNA-XIST在H1299细胞中的表达较低，我们选择敲低A549细胞中的LncRNA-XIST并在H1299细胞中过表达LncRNA-XIST以进行进一步的实验。

图1：LncRNA-XIST表达水平与NSCLC发展的相关性

LncRNA-XIST对NSCLC细胞增殖和凋亡的影响

为了研究LncRNA-XIST对NSCLC和HBE细胞功能的影响，将sh-LncRNA-XIST转染到A549细胞中，并将过表达的载体转染到H1299和HBE细胞中。结果表明，我们分别成功建立了LncRNA-XIST表达下调的A549细胞模型和LncRNA-XIST过表达的H1299和HBE细胞模型（图2A、2D、2G）。细胞计数和CCK-8结果显示敲低LncRNA-XIST抑制了A549细胞增殖（图2B、2C），过表达LncRNA-XIST则促进H1299（图2E、2F）和HBE细胞增殖（图2H、2I））。WB结果还显示，通过敲低A549细胞中LncRNA-XIST的表达，细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E2、CDK2、CDK4和CDK6等细胞周期相关蛋白表达下调（图2J，2K）。

同时，FCM结果显示敲低LncRNA-XIST增加了A549细胞的凋亡率（图3A、3B）。此外，敲低LncRNA-XIST也增加了A549细胞中的促凋亡蛋白（Caspase-3和Bax）并减少了抗凋亡蛋白Bcl-2（图3C、3D）。然而，作者的结果表明，在H1299细胞中，LncRNA-XIST过表达对细胞凋亡率（图3E、3F）和Caspase3的表达水平几乎没有影响（图3G、3H)。同样的，LncRNA-XIST过表达对HBE细胞凋亡几乎没有影响（图3I、3J）。

图2：LncRNA-XIST对NSCLC细胞增殖的影响

图3：LncRNA-XIST对NSCLC细胞凋亡的影响

LncRNA-XIST通过调节ROS诱导的细胞焦亡影响NSCLC细胞活力

作者的结果表明，敲低LncRNA-XIST增加了MDA和ROS水平（图4A、4E），并促进了A549细胞中超氧化物的释放（图4B），而在H1299（图4C、4D、4F）和HBE细胞（图4G）中，LncRNA-XIST的过表达不能影响细胞中的氧化应激。进一步的结果表明，LncRNA-XIST的下调激活了NLRP3炎性体，并增加了A549细胞中裂解的Caspase-1以及成熟的IL-1β（图4H、4I）。此外，IL-18的表达水平也因为LncRNA-XIST的敲低而增加（图4J）。以往研究证明氧化应激与细胞焦亡密切相关，ROS通过激活NLRP3炎性体诱导细胞焦亡。为了进一步验证LncRNA-XIST是否通过调节ROS的产生而影响细胞焦亡，作者使用了ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理A549细胞。结果表明，NAC处理逆转了LncRNA-XIST的敲低对A549细胞焦亡（图4K、4L）和增殖（图4M）的影响。此外，集落形成试验和CCK-8结果表明，NAC或细胞焦亡抑制剂NSA阻止了LncRNA-XIST的敲低对A549细胞增殖能力的抑制作用（图4N-4P）。

图4：LncRNA-XIST对NSCLC细胞系氧化应激和焦亡的影响

LncRNA-XIST敲低后通过调节SOD2影响ROS诱导的细胞焦亡

由于氧化应激可以通过多种基因改变来调节，因此作者探讨了可能涉及的基因。qPCR被用来筛选在LncRNA-XIST表达下调或上调的NSCLC细胞中差异表达的抗氧化基因（SOD1、SOD2、SOD3、GPX1、GPX2、GPX3、GPX7、FOXO3和Nrf2）（图5A、5B）。进一步的结果表明，LncRNA-XIST的表达水平和SOD2的mRNA的表达水平呈正相关（图5M）。结果显示SOD2的mRNA水平通过敲低A549细胞中的LncRNA-XIST显着下调，并通过H1299细胞中过表达的LncRNA-XIST而上调（图5A-5C）。同时，Western Blot结果证实SOD2的表达水平通过敲低A549细胞中的LncRNA-XIST被下调（图5D、5E），而过表达的LncRNA-XIST上调了H1299细胞中的SOD2的表达水平（图5F、5G）。值得注意的是，作者发现过表达的SOD2消除了下调LncRNA-XIST对A549细胞ROS的产生（图5I、5J）和细胞焦亡（图5K、5L）的影响。STRING共表达分析表明，SOD2与谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）、过氧化氢酶（CAT）、叉头盒蛋白O3（FOXO3）等氧化应激相关基因密切相关（图5H)。

图5：SOD2在LncRNA-XIST调节的细胞焦亡和ROS的产生中发挥的作用

LncRNA-XIST通过靶向miR-335调节SOD2的表达水平

之前的研究报道SOD2是miR-335的下游靶点，starBase软件预测miR-335是LncRNA-XIST的下游靶点（图6G）。作者的结果表明，与对照组相比，miR-335在NSCLC组织或细胞系中表达下调（图6A、6B），这与LncRNA-XIST和SOD2的表达呈负相关（图6C、6D）并与肺腺癌的泛癌分析一致（图6E、6F）。由于作者已经证明LncRNA-XIST调控SOD2的表达水平，因此推测LncRNA-XIST可能通过靶向miR-335调节SOD2。结果显示敲低LncRNA-XIST增加了A549细胞中的miR-335的表达水平（图6I）。同时，LncRNA-XIST的过表达抑制了H1299细胞中的miR-335的表达水平（图6J）。双荧光素酶报告基因系统结果表明，miR-335的模拟物通过与LncRNA-XIST的3'-非翻译区(UTR)结合而降低了荧光素酶活性（图6H）。此外，作者发现在敲低LncRNA-XIST的A549细胞中，miR-335抑制剂恢复了SOD2的表达水平（图6L、6N）。类似地，miR-335的模拟物消除了过表达LncRNA-XIST对H1299细胞中SOD2表达的促进作用（图6M，6O）。

图6：LncRNA-XIST通过靶向miR-335调控SOD2水平

通过调节miR-335/SOD2信号通路，LncRNA-XIST的敲低抑制了A549细胞活力并促进了细胞的凋亡

作者接下来研究了敲低LncRNA-XIST是否通过靶向miR-335/SOD2信号通路抑制NSCLC细胞的活力。菌落形成实验和CCK-8结果表明miR-335抑制剂逆转了敲低LncRNA-XIST对细胞增殖的抑制作用，然后通过协同敲低SOD2抵消了这种作用（图7A-7C）。此外，作者发现敲低LncRNA-XIST也以类似的方式通过靶向miR-335/SOD信号通路影响细胞凋亡（图7D、7E）。具体而言，miR-335抑制剂逆转了LncRNA-XIST的敲低对细胞凋亡的促进作用，同时通过协同敲低SOD2而被抵消（图7D、7E）。此外，敲低LncRNA-XIST增加了A549细胞中的ROS水平，这在miR-335抑制剂协同处理细胞中被抵消（图7F、7G）。作者还发现在NSCLC细胞系中，miR-335抑制剂成功抑制了芬戈莫德盐酸盐(FTY720)诱导的ROS水平。然而，miR-335抑制剂对FTY720诱导的ROS生成的影响并未通过敲低NSCLC细胞中的SOD2的表达而消除（图7H，7I），这表明FTY720可能通过靶向SOD2中的miR-335来调节NSCLC细胞中的氧化应激独立的方式。但是具体的机制仍有待阐明。

图7：通过靶向miR-335/SOD2轴LncRNA-XIST对A549细胞增殖和凋亡的影响

文章小结

基于上述研究，作者假设LncRNA-XIST可能通过靶向miR-335/SOD2信号通路参与NSCLC进展。此外，氧化应激和细胞焦亡也可能对NSCLC的发展至关重要。该研究将为临床治疗NSCLC提供潜在的治疗药物。