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1961年，Jacob和 Monod提出mRNA的概念后，各种各样调控RNAs分子的研究成为科研达人的新宠[1]。其中，lncRNA是一类不具有编码能力，可以协调遗传调控的类mRNA分子。目前，lncRNA的发现主要是通过以下三种途径（图1）：
传统的遗传学手段（如Xist、H19、HOTAIR以及植物中的HID1等）；
芯片方法（如乳腺癌、胰腺癌、肝癌等癌症相关的lncRNA等）；
高通量RNA-seq方法鉴定(新的lncRNA等)。
图1 .lncRNA的发现途径
lncRNA除了长度以及编码能力特点外，还具有一其他特点:
1.组织特异性高，表达量相对低于mRNA;
2.部分lncRNA的3’端特殊化，不含有polyA尾巴（图2）[2]。（一般lncRNA测序选择去核糖体的方法，因为可以得到更全面的lncRNA）；
图2.哺乳动物中lncRNA的多样化[2]
3.lncRNA定位多样化，细胞核、核质、胞浆等（图3）[3]；屁股决定脑袋，位置决定功能，这个一定要看清楚哦。
图3.lncRNA定位[3]
lncRNA之所以大红大紫，是因为他有着强大而独特的功能，包括表观调控染色质沉默、转录调控、转录后调控影响剪切体的剪切或者竞争性结合miRNA影响靶基因的表达等(图4)[4]。
图4.lncRNA作用机制[4]
针对芯片或者RNA-seq测序得到的显著差异表达的lncRNA，后续需要一系列的实验验证。包括表达验证、功能验证以及关键的互作验证其作用机理（图5）。
图5.lncRNA的验证
A.利用qRT-PCR验证差异表达的时候一定要注意，并不是所有的PCR产物反应的都是你要研究的lncRNA。所以在设计引物的时候一定要遵循以下建议：
cDNA质量一定要高，保证没有基因组DNA的污染；
按lncRNA类型排序,优先选择lincRNA>intron lncRNA>exon lncRNA(无重叠)；
按FPKM或reads count排序，优先选择表达量高的lncRNA；
按变化倍数排序，优先选择差异变化明显的lncRNA。
注：具体表达量或变化倍数，由整体测序深度和差异表达基因的数量决定。最好选择用于测序的cDNA去做PCR验证。退而求其次，用随机引物去反转cDNA，如果oligo(dT)反转，可能检测不到不含poly(A) 的lncRNA 。
B.Northern-blot既可以验证RNA的表达丰度又可以验证序列信息。但是呢，Northern Blot 比较繁琐，真的比较繁琐，而且精度不如qRT-PCR。
C.lncRNA全长获得
可以借助5’RACE和3’RACE试剂盒获得全长的lncRNA，对其结构做进一步分析。
D.lncRNA的定位
对于未知lncRNA，可以利用FISH(Fluorescence in Situ Hybridization )验证其亚细胞定位，一定要做，一定要做，一定要做，重要的事情说三遍，因为其亚细胞定位和调控功能有关，关系到后面缺失实验的成功。当然，也可以通过Northern Blot 粗略验证其是细胞核还是胞质定位，但是前提是可以分离到质量高的核RNA和胞质RNA。
利用RNA亚细胞定位数据RNALocate （http:// www.rnasociety.org/rnalocate）检索已知lncRNA的亚细胞定位。其实，该网站不仅提供lncRNA的定位信息，还包括其他RNA信息，包括csRNA、mRNA、miRNA、piRNA 、snRNA、rRNA、snoRNA和tRNA。当前版本的RNALocate更新至2016年6月，共建档了超过37700条具有实验证据RNA的亚细胞定位，涉及65个物种（主要包括人、小鼠、和酿酒酵母等），超过22000条RNA和42种亚细胞定位（主要包括细胞核、细胞质、内质网和核糖体等等）。可以分别通过Localization、Organism和RNA Category进行检索，大大方便后续实验研究（图6）[5]。
图6.数据库RNALocate
E.编码能力验证
生信分析过程中，虽然我们已经利用多种编码能力预测其编码能力，但是，但是有个万一呢？所以，如果实验室条件允许，大家还是可以利用试剂盒体外验证编码能力。革命需要流血，大paper 是需要多重验证的，这个你懂得。
做实验最重要的是功能验证，只有这样才能得到老板的赏识，当然最重要的是，可以发高分文章毕业啊。所以，还是一步一步锁定目标，做做功能验证，看看此lncRNA是什么鸟，能否助我毕业一臂之力。
A.功能获得
构建lncRNA过表达载体，观察过表达lncRNA后对细胞增殖、凋亡、侵袭或者植物开花、果实成熟以及生长素响应等的影响，验证lncRNA靶基因的表达丰度。
注意！注意！不要一提到过表达就想到35S，其实，组织特异表达的lncRNA的过表达验证需要考虑组织特异的启动子，这样更有针对性。
B.功能缺失
研究lncRNA功能缺失的时候，首先，一定要根据其亚细胞定位选择合适的缺失方法。常见的功能缺失方法是借用siRNA或者shRNA，感染细胞，但是很多时候我们发现细胞的感染效率很高，但是lncRNA的干扰效率却很低。其实，RNA干扰作用发生在胞浆内，如果要研究的lncRNA定位在细胞核中，那siRNA或者shRNA真是鞭长莫及啊。如果lncRNA定位在细胞核中，那我们就用大招。可以选择RNAi、 CRISPR/Cas9 、反义寡核苷酸、位点反转、启动子缺失等方法干扰（图7），但是，最合适的方法还是需要自己摸索，自己多尝试[6]。
图7.lncRNA功能缺失方法
lncRNA可谓是“文武双全”，可以和RNA、DNA、蛋白等结合发挥作用。对于lncRNA 功能的研究，我们可以通过研究和其互作的分子来推测进而进行机理研究。利用已知蛋白的抗体去捕获RNA分子或者是利用标记的已知RNA分子的互补核苷酸去捕获与其互作的蛋白。
A.RIP(蛋白已知，RNA未知)
RIP（RNA immunoprecipitation）又称为RNA结合蛋白免疫沉淀技术，可以说是RNA界的ChIP（染色质免疫沉淀），该技术能帮助人们分析与RNA结合蛋白相关的核酸。利用与RNA结合的蛋白的抗体，从细胞提取物中捕获与蛋白相结合的RNA，再通过qPCR、芯片或二代测序技术对这些lncRNA进行鉴定（图8）。
RIP以外，CLIP（UV crosslinking and immuno-precipitation）和iCLIP （individual-nucleotide resolution CLIP）也可以帮助人们捕捉与RNA结合蛋白互作的RNA分子。
图8.RIP实验流程
B.RNA-Protein pull down(RNA已知)
RNA-Protein Pull-Down 实验是利用已知的RNA分子去捕获已知的或者未知的结合的蛋白分子。基本步骤包括：目标（已知）RNA生物素标记，磁珠富集，RNA结合蛋白的孵育，RNA 结合蛋白的洗脱，WB（已知蛋白验证）或者MS(未知蛋白检测)（图9）。
图9.RNA-Protein pull-down实验流程
C.EMSA
RNA EMSA是通过凝胶电泳迁移检测蛋白-RNA互作的一种技术，和DNA水平的EMSA相似。首先，标记的RNA探针和蛋白孵育，当蛋白-RNA复合体形成后，利用非变性聚丙烯酰胺凝胶分离。相对于游离的RNA分子来说，蛋白-RNA复合物的迁移速率慢。特异性的结合可以通过多于的未标记的探针的竞争结合证明。一般情况下，结合位点的突变或者是无结合能力的RNA探针是无法竞争特异性的结合的（图10）。
图10.EMSA实验流程
参考文献
[1].Jacob F, Monod J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins[J]. Journal of molecular biology, 1961, 3(3): 318-356.
[2].Chen L L. Linking Long Noncoding RNA Localization and Function[J]. Trends in Biochemical Sciences, 2016, 41(9): 761-772.
[3].Quinn J J, Chang H Y. Unique features of long non-coding RNA biogenesis and function[J]. Nature Reviews Genetics, 2016, 17(1): 47-62.
[4].Mercer T R, Dinger M E, Mattick J S. Long non-coding RNAs: insights into functions[J]. Nature Reviews Genetics, 2009, 10(3): 155-159.
[5].Zhang T, Tan P, Wang L, et al. RNALocate: a resource for RNA subcellular localizations[J]. Nucleic Acids Research, 2016: gkw728.
[6].Bassett A R, Akhtar A, Barlow D P, et al. Considerations when investigating lncRNA function in vivo[J]. Elife, 2014, 3: e03058.
摘自美吉生物
