RNA-seq的基本实验路线：

RNA通常是从新鲜分离的或冷冻的细胞和组织样本中分离出来，一般使用商业化试剂盒，如RNA Easy，Trizo或者RiboPure等。这些试剂盒很容易操作，在使用正确的情况下可以提取出大量的总RNA。现在，高通量的RNA提取方法也已存在，主要依赖于可以吸附RNA的磁性粒子，这些粒子便于清洗和分离。另外，从福尔马林固定和石蜡包埋的组织中也能够提取一定量的RNA。为了防止RNA降解，样品可以浸没在RNA存储试剂中，如RNA Later (Ambion公司)，或者经处理后保存在酚类乳剂中(Trizol)。在此阶段，RNA也可根据核苷酸长度大小的等级被特异富集，例如，可用特定离心柱将小RNA富集 (miRVana, Ambion)。另一种特异分离方法是，将样本进行总RNA分离，然后跑聚丙烯酰胺凝胶电泳进行筛选。

在几乎所有的总RNA提取实验中，样本都面临着被基因组DNA污染的可能，这是不可避免的。即使这种污染很小，RNA-seq的灵敏度和高通量性也会导致这些污染物最终被捕获。因此，常规的RNA样品均采用DNase处理，在文库制备前消化基因组DNA。大多数DNase试剂盒均提供可以抑制DNase活性的试剂，当DNA已被消化时，DNase便可被失活。制备RNA-seq文库时所需的总RNA质量各不相同，标准的文库制备需要0.1-10μg的总RNA，而精确度特别高的操作甚至能够用10pg的RNA进行文库制备。现如今，越来越普遍的是从单个细胞中将RNA提取出来，针对于此的特异试剂盒也正在被不断开发出来。

最佳范例要求RNA在进行文库准备之前，对降解程度（完整度）、纯度和数量进行质量检测。有很多平台可以对RNA进行不同层面的质检。Nanodrop和类似的仪器可在260nm和280 nm处检测核酸样品的荧光吸收（260nm为核酸吸收峰，280nm为蛋白质吸收峰），它只需要1ul的液体来进行测量，并且样品可以被稀释。这样，使用纳米级的起始样本数量就可以完成一次检测。这类设备很容易使用，仅需要几秒钟的时间来读取数值，并且可以同时处理许多的样本。但是，这类设备仅是通过检测在260nm处的荧光吸收峰算出核酸大致含量，它并不能区分RNA和DNA，因此不能指出RNA样本是否被DNA污染。并且，降解的RNA所测得的数值与完整的RNA测得的数值并无二致，因此我们无法了解样品的真实质量。但是，OD260 / 280的吸收比值却可以提供给我们一些蛋白质污染的信息，RNA的OD260/280≈2.0-2.2，小于2.0说明有蛋白质污染。OD260/230≈2.3，小于2.3说明有碳水化合物或酚残留。

因为吸取纳升范围内体积的样品超出了普通实验室所使用的移液枪的量程极限，因此即使只吸1ul进行测量（最低浓度单位是ng/ul），用Nanodrop等仪器测量所得数值的精确度也不可靠。而只检测核酸及其衍生物的Qubit Fluorometer (Life Technologies)及类似仪器可以直接检测核酸，要么RNA，要么 DNA。通过使用低浓度样本进行测量、在校准的标准回归曲线上添加荧光值以及随后基于回归曲线进行样本荧光吸收图的绘制，这样，就实现了更具体，更准确，更广泛的RNA动态测量。此外，小于1ul就足以测量，同Nanodrop等仪器一样，样品也可以被稀释。这类仪器使用也很简单，但仍然不能提供任何有关RNA降解的信息。为了解决这个问题，我们需要使用下面这种仪器。

安捷伦生物分析仪是一种功能强大的用于测定核酸的微流体毛细管电泳系统及数据评价工具，它结合了上述仪器的所需检测体积小（1µL样品消耗量即可，仅使用50 pg的总RNA）和灵敏度高的优点，以凝胶图谱和电泳图谱展示RNA 质量分析的结果，即使是轻微的降解也可轻易地被检测出来。当电泳结束后，分析仪根据电泳后RNA的大小和量提供给我们关键的信息，不仅是浓度，还有核酸的质量。降解的RNA在电泳时会在低分子量的条带位置上呈现弥散状，而完整的RNA具有明显的理想条带（植物可分为28s，18s，5s，且以28s条带亮度为18s条带亮度的1-2倍为较好，5s一般很弱甚至没有，见图1.2），并且仪器上的电泳图谱界面会显示出锋利的28S和18S峰。安捷伦生物分析仪包含一个微芯片，可避免分析过程中样品发生降解，它可以控制上样量的大小，并且一次最多的上样量可达12个样本（现如今随着技术的创新，这些数值都在提高）。样品与荧光染料混合后，便可通过毛细管进行电泳。该仪器的集成数据分析管道可以把电泳数据转化为类似凝胶的图像，让用户更习惯于传统的凝胶电泳。

图1.2 理想的RNA简易电泳图（上图较好的RNA电泳图片。为节省实验时间，采用的是比较省时的琼脂糖凝胶电泳，电泳液为TAE缓冲液。胶浓度为1.2%，电压180v，时间22min），下图则为发生严重降解的。

下图1.3所示，为一个安捷伦生物分析仪对某样品做的电泳图谱。

图1.3 Agilent生物分析仪所显示的RNA质量检测结果。左图为Ladder的峰图，右图则为实际样品的质检峰图。RIN值（RNA Integrity Number）是另一个重要指标，该RIN值参数已经成为RNA研究领域内RNA质量评估的黄金标准。特别是在实时荧光定量PCR (qPCR)实验前的RNA样品质量控制部分，完整的RNA是保证实验成功和优异重复性的最重要保障。

供稿：郭鹏

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