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最近小编读到一篇关于 m6A 修饰的文章，Huilong Yin等人以“RNA m6A methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming ”于3月份发表自Nature Communications(IF:12.121)，主要研究RNA m6A甲基化在巨噬细胞中的功能和作用机制。思路清晰、手段全面、机制详尽。强烈建议收藏！！长文预警！！
一、研究背景和待解决的科学问题
前期的研究表明肿瘤微环境对巨噬细胞（TAMs）的基因表达进行了重新编程，以重塑和维持免疫抑制功能。TAM通常表现出一系列激活状态。通常，它们偏离“经典”激活的抗肿瘤表型（称为M1），而偏向“另类”激活的肿瘤表型（M2）。然而，就像许多其他组织中的巨噬细胞一样，TAM显示出显着的功能可塑性，并经常表达两种激活状态的标志物。
目前对于RNA 表观遗传研究最热门的就是m6A的修饰。 据报道，作为甲基转移酶复合物的催化亚基的METTL3参与了多种生物学过程。此外，m6A异常修饰经常见于癌症，例如肺癌和结肠腺癌，并根据分子靶点在不同肿瘤中发挥其进行性或抑制性作用，且m6A修饰与免疫调节有关，但由于大多数研究主要集中于肿瘤内在的致癌途径，因此很大程度上未知m6A修饰在宿主抗肿瘤免疫反应中的潜在作用。
因此，本文要解决的问题，就是要对m6A修饰在巨噬细胞中的功能和作用机制进行研究。
二、结果
1、Mettl3的髓样特异性缺失促进肿瘤生长和转移
为了研究m6A修饰在巨噬细胞中的功能，研究者将WT BMDM（骨髓来源的巨噬细胞）与B16细胞或B16细胞培养基共同孵育。 结果表明：
（1）Mettl3的表达显着降低，而Mettl14的水平没有明显的差异。
（2）蛋白质印迹分析还证实了METTL3蛋白表达降低。
为了进一步表征Mettl3基因的表达，研究者从同一宿主小鼠的肿瘤组织和BMDMs中分离了TAM，并确定在肿瘤进展过程中TAM中Mettl3转录物的水平降低了。
那么髓样细胞中的Mettl3是否调节肿瘤的进展？qRT-PCR和蛋白质印迹结果表明：
（1）来自KO小鼠的BMDMs的Mettl3 mRNA表达降低了约75％，而PMs的降低了约80％；
（2）KO BMDMs中m6 mRNA的水平低于WT BMDMs中的m6A水平。
接下来的问题是Mettl3的髓样特异性缺失是否影响肿瘤的生长？研究者将B16或LLC细胞皮下注射到同系WT或KO小鼠中。与WT小鼠相比，KO小鼠表现出明显更快的肿瘤生长，并且这些条件性Mettl3基因敲除小鼠的存活期缩短了（图1a-d）。此外，为了确定METTL3是否可以影响肿瘤转移，通过尾静脉将B16或LLC细胞注入小鼠体内。生物发光成像表明，与野生型小鼠相比，KO小鼠的肺转移增强了（图1e，f）。
上述 METTL3 缺失对肿瘤进展的影响结果非常显著，但是研究者尚不能确定BMDMs中Mettl3的缺失是否会促进肿瘤生长。为了进一步探讨，研究者建立了巨噬细胞和肿瘤细胞的混合模型。结果表明（图2a-k）：
（1）CFSE标记的细胞对F4 / 80染色呈阳性。
（2）B16或LLC细胞与KO BMDM共同注射可显着加速肿瘤的生长。
（3）生物发光成像显示，巨噬细胞耗竭消除了WT和KO小鼠之间肿瘤生长和转移的差异。
两者合计，以上数据表明METTL3在巨噬细胞中在促进肿瘤进展中起着至关重要的作用。
2、巨噬细胞中的Mettl3缺失通过增强M1和M2样TAM和Treg浸润到肿瘤中来重塑肿瘤微环境。
已经明确METTL3在巨噬细胞中在促进肿瘤进展中起着至关重要的作用，因此下一步就是评估METTL3对免疫微环境的影响。研究者通过流式细胞术对脾脏和肺进行免疫分型，并确定M1巨噬细胞、M2巨噬细胞和调节性T细胞的总百分比增加。
为了进一步研究METTL3对肿瘤微环境的影响，研究者通过：
（1）单细胞RNA测序分析了WT或KO小鼠肿瘤中的CD45 +细胞，揭示了23种不同的肿瘤内免疫细胞群。KO小鼠的肿瘤与WT小鼠的肿瘤相比，免疫浸润液的成分有所不同，包括TAM，MDSC和CD4 + T细胞数量增加以及粒细胞和CD8 + T细胞数量减少的趋势。
（2）通过流式细胞术用METTL3缺失型巨噬细胞对肿瘤组织进行免疫表型分析显示，M1和M2样TAM的总百分比增加（图3a）。此外，MDSC和调节性T细胞的数量也有增加的趋势（图3b-d），而CD3 + CD4 +和CD3 + CD8 + T细胞的总百分比没有受到影响。
先前的研究表明，Treg迁移和浸润到各种肿瘤组织中似乎取决于肿瘤细胞或浸润巨噬细胞产生的CCR4配体（CCL22）的表达，因此研究者在进一步研究中发现在缺乏Mett13的BMDM和TAM中CCL22表达显着上调。这些发现促使研究者检查Treg缺失对肿瘤生长和转移的影响。研究者研究了注射抗CD25抗体对Tregs水平的影响。
结果表明巨噬细胞中的Mettl3缺失以依赖于M1 / M2样TAM浸润和Treg募集的方式促进了肿瘤的生长和转移。
3、Mettl3缺失通过NF-kB / STAT3促进BMDM的M1和M2极化
为了表征METTL3可能参与巨噬细胞极化， qRT-PCR结果表明，在缺乏Mettl3的BMDM中，Tnf-α，Il-6和Arg1的表达明显上调。
接下来，研究者测试了M1和M2巨噬细胞相关基因的表达，发现在Mettl3缺失的BMDM中（图4a-c）：
（1）Tnf-α，Il-6和Arg1的表达显着增加。
（2）TNF-α和IL-6的表达上调，而IL-10的表达则相对不变。
（3）精氨酸酶活性的提高。
由于NF-κB是宿主先天性和适应性免疫反应的主要参与者，调节促炎性细胞因子的表达，而STAT3是MDSC扩展的主要驱动力之一，并参与髓样细胞介导的免疫抑制。因此研究者评估了BMDM中p65和STAT3的磷酸化，结果表明（图4d-f）：
（1）Mettl3缺失的巨噬细胞中p65和STAT3的磷酸化水平增加。
（2）抑制NF-κB降低了WT BMDM和KO BMDMs中Tnf-α，Il-6和Arg1的表达，
（3）抑制STAT3途径降低了Arg1的表达。
（4）ChIP分析表明，p-STAT3与Arg1的启动子特异性结合。
接下来，研究者通过流式细胞仪检测的TAM纯度。结果表明，KO TAM中M1和M2巨噬细胞相关基因的表达同时增加，这与p65和STAT3的磷酸化增强以及ARG1的表达增强（图4g–i）。
总体而言，METTL3的缺失导致NF-κB通路和STAT3信号的激活，从而导致M1和M2样巨噬细胞极化。
4、肿瘤细胞促进细胞因子的产生以及Mettl3缺失巨噬细胞中NF-κB和STAT3的激活
由于NF-κB和STAT3可以受到细胞外刺激的调节，因此研究者用外源性因子TNF-α或IL-6刺激了BMDM，其中：
（1）免疫印迹结果表明，与野生型BMDM相比，KO BMDM中诱导p-p65和p-STAT3的能力更为明显。
（2）qRT-PCR分析显示，Tnf-α和Il-6的表达随TNF-α处理而增加，而被Bay-11-7082阻断NF-κB通路则被逆转，而Arg1的表达随响应而增加。 IL-6治疗后被STAT3抑制剂S3I-201逆转。
总而言之，与WT BMDM相比，KO BMDM中NF-κB/ IL-6 / STAT3信号转导轴的活化程度更高。
接下来评估NF-κB/ IL-6 / STAT3信号转导轴在肿瘤微环境中的作用，将B16或LLC细胞与BMDM培养基或BMDM一起孵育。结果表明（图5a-f），
（1）在p16磷酸化增强的B16和LLC细胞中，Il-6的表达上调，并通过用Bay-11-7082阻断NF-κB途径逆转了Il-6的表达。
（2）TNF-α处理不仅以剂量和时间依赖性方式增加p65的磷酸化，而且还增强Il-6的表达。并且使用NF-κB抑制剂BAY进行处理-11-7082逆转了肿瘤细胞中Il-6的表达。
（3）qRT-PCR分析表明，添加Bay-11-7082或抗TNF-α中和抗体可抑制Il-6的表达，同时降低p65和STAT3磷酸化。
（4）与WT BMDM相比，在存在抗IL-6中和抗体的情况下与B16或LLC细胞共培养的Mettl3缺陷型BMDM中，Arg1的表达显着降低。
总之，这些数据表明Mettl3缺失的巨噬细胞通过调节细胞因子应答来重塑肿瘤微环境。
5、METTL3的丢失会损害YTHDF1介导的SPRED2的翻译。
为了研究m6A在巨噬细胞重编程中的作用，使用m6A甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-Seq）从WT和KO BMDM中分离了总RNA样品以进行m6A分析。
为了表征参与m6A调节的巨噬细胞极化的潜在靶标，研究者鉴定了具有关键功能的MAPK途径相关基因和70个m6A下调的基因之间重叠的候选基因（图6c-g）：
（1）在这些基因中，Spred2被发现是控制ERK信号的负调节剂，而Spred2被发现具有显着降低的m6A水平。
（2）m6A免疫沉淀（m6A-IP）和qRT-PCR证实了Spred2是m6A调控的靶基因。
（3）KO BMDM和TAM中SPRED2蛋白表达降低，而mRNA水平没有明显改变。
（4）mRNA衰减分析表明，m6A修饰不会明显影响Spred2的衰减。
为了研究在Mettl3缺失的BMDM中SPRED2蛋白表达的下调的原因，研究者假设其可能是由于YTHDF1控制的蛋白翻译效率的差异所致。通过多核糖体谱分析将分离出的RNA从WT和KO BMDM中分离为非翻译部分和翻译活性多核糖体。qRT-PCR显示，Mettl3缺陷型BMDM的翻译活性多核糖体中的Spred2 mRNA水平显着低于WT BMDM的Spred2 mRNA水平。
接下来，研究者为了测试METTL3是否被募集到Spred2启动子并影响Spred2表达。因此研究者使用了一个报告系统，该系统由一个在萤火虫荧光素酶基因上游具有Spred2启动子片段的质粒组成。同时为了直接解决METTL3对SPRED2的翻译的催化活性的要求，研究者在BMDM中过表达了WT METTL3或mut METTL3。结果表明METTL3的催化活性在SPRED2的翻译中起着至关重要的作用，而与启动子的结合无关。
紧接着研究CDS中的m6A甲基化是否可以调控SPRED2的表达，研究者分析了人类和小鼠SPRED2保守的m6A基元，并将两个可能保守的m6A基元GGAC分别突变为GCTC (SPRED2 -CDS mut1或SPRED2 -CDS mut2)或同时突变为GCTC (SPRED2 -CDS mut1/2)。结果显示（图6j-l）：
（1）Spred2-CDS mut2和Spred2-CDS mut1 / 2降低了SPRED2的水平，但Spred2-CDS mut1并未降低，这表明Spred2-CDS mut2中的m6A基序是表达调控的主要位点。
（2）RNA-IP分析表明与WT BMDM相比，在缺乏Mett13的BMDM中，YTHDF1和Spred2之间的结合显着降低了。
为了确认YTHDF1在m6A调节的SPRED2表达中的作用，我们敲除了YDMDF1在BMDMs中的表达。 结果表明：
（1）YTHDF1敲除减弱了BMDM中SPRED2的表达，并伴有ERK，NF-κB和STAT3磷酸化的增加。
（2）qRT-PCR分析显示，在敲除YTHDF1后，Tnf-α，Il-6，Arg1和Ccl22的表达增加。
（3）敲除BMDM中的SPRED2导致ERK，NF-κB和STAT3磷酸化的上调，伴随着Tnf-α，II-6，Arg1和Ccl22的表达增加。
总体而言， BMDM中Mettl3的缺失导致YTHDF1介导的SPRED2的翻译减少以及ERK，NF-κB和STAT3磷酸化的上调。
6、巨噬细胞中的Mettl3缺失削弱了B-1肿瘤中PD-1阻断治疗的疗效
为了评估靶向METTL3激活抗肿瘤反应的潜力，研究者在B16肿瘤转移模型中测试了抗PD-1治疗。 发现KO小鼠中的B16肿瘤对抗PD-1治疗的反应较弱，表现出肿瘤生长和肺转移大大增加，并且生存期缩短（图7a-f）。
这表明缺乏Mettl3的髓样细胞促成B16肿瘤对抗PD-1治疗的耐药性。
三、结论
总结一下这篇文章的思路：
1. 明确了METTL3在巨噬细胞中在促进肿瘤进展中起着至关重要的作用。
2. 评估METTL3对免疫微环境的影响。
3. 对METTL3是否参与巨噬细胞极化进行验证。
4. 评估NF-κB/ IL-6 / STAT3信号转导轴在肿瘤微环境中的作用表明Mettl3缺失的巨噬细胞通过调节细胞因子应答来重塑肿瘤微环境。
5. 研究m6A在巨噬细胞重编程中的作用，接着确认YTHDF1在m6A调节的SPRED2表达中的作用。
6. 评估靶向METTL3激活抗肿瘤反应的潜力。
本文从大到小逐级深入研究，思路清晰，不失为一篇参考价值极高的文献！
