“无声”的缺氧已经成为2019年冠状病毒疾病（COVID-19）的独特特征。前期研究发现粘蛋白在COVID-19患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）中积累，并在严重呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染的小鼠和猕猴的肺中上调。近期华中科技大学同济医学院和北京协和医学院研究团队携手合作，为我们揭秘新冠缺氧新机制。相关研究成果以 “Mucus production by IFN-AhR signaling triggers hypoxia of COVID-19”为题，于近期在线发表在《Cell Research》杂志上，IF：20.507分。

背景介绍

由SARS-CoV-2引起的COVID-19紧急暴发已引起全球大流行。总体而言，急性呼吸道疾病综合征（ARDS）是主要的临床症状。COVID-19进入严重阶段后，将变得非常难以管理，并导致患者死亡。目前， SARS-COV-2感染仍是一个谜。人们普遍认为，不受控制的炎症参与患者死亡以及靶向关键促炎细胞因子IL-6或JAK / STAT炎症途径已经被调查在危重患者COVID-19起到关键作用。爆发性的促炎细胞因子会损害肺泡上皮和内皮细胞，导致毛细血管通透性和肺纤维蛋白溶解，从而阻碍氧气（O₂）和二氧化碳（CO₂）的交换并导致缺氧，这是引发COVID-19诱导的关键因素死亡。然而，缺氧似乎出现在COVID-19的早期阶段，而过度的炎症出现在相对较晚的阶段。临床实践已经观察到，许多COVID-19的患者最初具有氧剥夺但没有呼吸问题，提示促炎细胞因子之前的其他因素可能会导致COVID-19诱导的缺氧。粘液覆盖着呼吸道的细胞表面，这对于确保捕获吸入的颗粒和病原体至关重要。在生理上，通常通过纤毛的运动将粘液排出，这也防止了细支气管粘液落入肺细胞不表达纤毛的肺泡内腔。但是，粘液在肺泡中的黏附和积累可能会增加血气屏障的厚度，从而阻碍O2和CO2的交换。尸检报告显示，在COVID-19患者的肺中有大量灰白色粘性液体。而且在肺癌手术后被诊断出的COVID-19患者中也观察到蛋白质渗出物。此外，一项来自单细胞测序的新研究报道了粘蛋白在COVID-19患者的肺上皮细胞中的表达。这些发现促使该研究团队假设SARS-CoV-2感染会刺激粘液产生，从而通过阻碍O2在肺泡部位的扩散来促进缺氧。

方法

1、分离Ⅱ型原发性肺泡上皮细胞：从ICR小鼠或AhR ^{– / –}小鼠中分离出II型初级肺泡上皮细胞。

2、蛋白质印迹：收集细胞，在M2裂解缓冲液中裂解并超声处理。

3、免疫荧光：将细胞固定在4％多聚甲醛中，并用0.2％Triton X-100透化。对于肺切片，将组织固定在10％福尔马林中。

4、组织学和免疫组化（H＆E）染色：将小鼠的肺组织或COVID-19患者的BAL固定在10％福尔马林中，包埋在石蜡中，然后切片进行H＆E染色。

5、实时PCR：使用Trizol（Invitrogen）从细胞中提取总RNA，并使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems，CA）将其转录为cDNA。

6、定量PCR：使用MAGnity ^TM染色质免疫沉淀系统进行ChIP-qPCR 。

7、动物实验和治疗方案：每天一次通过气管用IFN-β（1μg/小鼠），IFN-γ（10μg/小鼠），IFN-β+ CH223191（10 mg / kg）或IFN-γ+ CH223191处理ICR小鼠，1天4次。

8、O2（PO2）分压分析：麻醉小鼠，并从静脉抽取血液。立即使用Roche Cobas b123全自动血气分析仪（Roche）检测PO ₂的水平。

结果

肺下叶支气管炎和干咳在COVID-19患者中很常见，提示SARS-CoV-2侵入下呼吸道和肺泡区域的肺上皮细胞。因此，如果SARS-CoV-2刺激粘液产生，则应在支气管肺泡灌洗液（BAL）中发现肺泡中存在的粘液。因此，从八名COVID-19患者中收集了用于病理诊断的石蜡包埋的BAL。粘液呈酸性，苏木精-曙红染色显示细胞外成分被染成红色。粘液的粘度在于连接的寡糖，可通过高碘酸席夫（PAS）染色。正如预期的那样，PAS染色显示BAL中含有丰富的碳水化合物，表明COVID-19患者的BAL中可能存在粘液样物质。粘蛋白是粘液的主要成分。因此，该研究团队进行了额外的免疫化学染色，并在BAL中分别鉴定出一组粘蛋白，包括分泌的形成凝胶的粘蛋白2、5A，6和7以及与膜连接的粘蛋白13。与该结果一致的是，在SARS-CoV-2感染的猕猴中，粘蛋白2、5A和5B的表达显着上调。总之，这些结果表明，粘液很可能在COVID-19患者的肺上皮细胞中产生。

图1、黏蛋白在肺泡上皮细胞中被IFN上调

接下来，该研究团队研究了SARS-CoV-2感染触发黏蛋白表达的分子途径。SARS-CoV-2可能进入并直接刺激肺上皮细胞表达粘蛋白。人肺上皮细胞系BEAS-2B是血管紧张素转换酶2（ACE2）阳性，可能被SARS-CoV-2感染。然而，SARS-CoV-2颗粒与BEAS-2B细胞的孵育并没有导致上调，甚至没有降低粘蛋白的表达，如实时PCR所证明的那样，提示在SARS-CoV-2感染期间诱导粘蛋白表达的另一种方法。众所周知，I型干扰素是响应病毒入侵的第一个警报，其信号激活一组基因，包括蛋白激酶R和Mx蛋白，以发挥直接的抗病毒作用。²⁰实际上，在SARS-CoV-2感染的hACE2转基因小鼠中，IFN-β的表达以时间依赖性的方式显着上调。此外，在COVID-19患者的BAL中也观察到了中等程度的IFN-β表达。然后，该研究团队用IFN-β处理BEAS-2B细胞。该研究团队发现，IFN-β处理可在mRNA和蛋白质水平上调黏蛋白1、2、5A，5B，6、7、12和15-20的表达。此外，该研究团队还发现在IFN-β处理后，原代小鼠肺泡上皮细胞表达高水平的粘蛋白。与这些结果一致，吸入IFN-β会增加小鼠肺中粘蛋白的产生，表明IFN-β能够诱导肺上皮细胞产生粘蛋白。除I型干扰素外，抗病毒T细胞免疫性至关重要的IFN-γ在受SARS-CoV-2感染的转基因小鼠的肺中也有所增加。该研究团队进一步证明了那些分泌形式或膜结合粘蛋白可以被IFN-γ诱导。来自SARS-CoV-2感染的hACE2转基因小鼠的肺组织中粘蛋白1、2、5A，5B和18的水平升高进一步支持了这一结果。使用粘蛋白1、5A和5B作为代表，该研究团队还发现这些粘蛋白与表面活性剂蛋白C（SPC）共定位，该蛋白是II型肺泡上皮细胞的标志物。鉴于IL-6 SARS-CoV的-2感染期间中高度升高^21，22该研究团队另外使用IL-6治疗原发性肺上皮细胞。但是，该研究团队发现IL-6不会上调细胞中粘蛋白的表达。总之，这些结果表明，SARS-CoV-2感染诱导的IFN可以诱导肺上皮细胞上调粘蛋白表达。

图2、干扰素通过IDO / AhR依赖性途径诱导粘蛋白表达

然后，该研究团队探讨了干扰素调节粘蛋白表达的分子机制。与受体结合后，IFN-β和IFN-γ分别激活经典的STAT2和STAT1信号通路。另外，IFN-β和IFN-γ也可以激活细胞质转录因子芳烃受体（AhR）。在该研究团队最近的研究中，该研究团队发现IFN-β和IFN-γ都能通过吲哚胺-吡咯2,3-双加氧酶（IDO）-Kynurenine（Kyn）途径激活AhR。详细来说，IFN激活的STAT1可以上调IDO表达，从而触发Kyn-AhR信号通路。作为一种酶，IDO催化色氨酸向Kyn（AhR的内源性配体）的转化。该研究团队发现，肺上皮细胞中的IFN会上调IDO水平，同时生产Kyn。作为一种关键的细胞质转录因子，AhR在激活时易位到核中，并通过与称为二恶英反应元件（DRE）的特定DNA序列结合来调节基因表达。该研究团队发现添加AhR抑制剂CH223191可以阻断IFNs对BEAS-2B和原代肺上皮细胞黏蛋白表达的影响。此外，IFN几乎完全丧失了对AhR ^{– / –}原代细胞中粘蛋白表达的影响。像IFN一样，AhR的配体Kyn也能够上调BEAS-2B细胞以及分离的鼠肺泡上皮细胞中黏蛋白的表达。在IFNs或Kyn刺激后，观察到AhR易位到细胞核中。随后，通过染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR）验证了AhR与多个粘蛋白基因（MUC1、2、5A，5B，13和16）的启动子的结合。使用hACE2-转基因小鼠作为SARS-CoV-2感染模型，还证实了AhR核易位。值得注意的是，这种核易位似乎与IFN-β的水平有关。SARS-CoV-2攻击后，转基因小鼠肺中IFN-β的mRNA含量逐渐升高，同时增加AhR进入细胞核并增加粘蛋白的mRNA表达。总之，这些结果表明，IFN通过IDO / AhR依赖性途径诱导肺上皮细胞中的粘蛋白表达。

图3、AhR阻滞改善了感染小鼠的肺部病理

最后，该研究团队调查了AhR激活诱导的粘液是否导致缺氧和肺活量减少。据报道，I型干扰素可募集并激活先天免疫细胞，后者会产生高水平的炎症介质从而促进组织的炎症损伤。在这里，该研究团队使用IFN-β或IFN-γ通过支气管雾化方法对小鼠进行治疗，发现IFN-β和IFN-γ能够降低O ₂（SpO ₂）的分压，导致缺氧，同样会增加Rrs（呼吸系统阻力），Ers（呼吸系统弹性），PV-k（压力/容积环放气肢体上部曲率）和Eta（组织滞后性），表明小鼠的肺功能受损。然后，该研究团队通过向小鼠静脉内注射AhR抑制剂来阻断AhR途径。在这种情况下，小鼠中的IFN-β-或IFN-γ诱导的呼吸功能损害被消除。与此结果一致，AhR阻断也抑制了IFN处理小鼠肺中粘蛋白的表达。此外，该研究团队用SARS-CoV-2感染了hACE2-转基因小鼠，然后每天进行一次CH223191治疗。该研究团队发现5天的治疗导致粘蛋白1、4、5A，5B和16的粘蛋白明显减少，并减少了肺部的病理损伤。与这些结果一致，该研究团队发现CH223191治疗可以逆转SARS-CoV-2感染诱导的外周血PO ₂降低。总之，这些结果表明，AhR阻断改善了SARS-CoV-2感染小鼠的肺部病理。

图4、AhR抑制逆转了IFN-β或IFN-γ诱导的肺功能恶化

结论

该研究团队发现，SARS-CoV-2感染后诱导干扰素（IFN）-β或IFN-γ会通过IDO-Kyn依赖性途径激活芳烃受体（AhR）信号，从而导致表达的转录上调肺泡上皮细胞中粘液的分泌和膜结合。因此，积聚的肺泡粘液会影响血气屏障，从而引起缺氧并降低肺活量，这可以通过阻断AhR活性来逆转。