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经典生信思路：构建肿瘤代谢相关风险预测模型
导读
前段时间我们公众号推了一篇与肿瘤代谢和肿瘤免疫相关的文章，在那篇文章的思路扩展中就提到了用生信的角度解读肿瘤代谢和肿瘤免疫。今天和大家一起学习一篇发表在《Frontiers in Immunology》的一篇文章，在这篇文章中，作者构建一个与代谢相关的基因图谱来预测前列腺癌(PCa)的复发和治疗反应。因为PCa是男性最常见的恶性肿瘤。虽然近几十年来PCa的临床治疗取得了很大进展，但是，一旦其对治疗产生耐受性，PCa会在复发后会迅速发展。并且PCa从早期肿瘤转变为晚期肿瘤的过程中一直表现出一种独特的代谢重编程。然而，对于PCa代谢格局的改变与肿瘤复发和治疗反应的关系缺乏系统和全面的研究。
结果解读：
为了在基因水平上系统和全面地研究PCa的代谢情况，作者先从TCGA PCa数据集中筛选出了代谢相关的差异表达基因 (mDEGs)（图1A）。接下来作者使用GO分析和KEGG分析来研究这些基因的功能。GO分析显示mDEGs与脂肪代谢、氨基酸代谢、激素代谢和羧酸生物合成等有关 (图1B)。KEGG富集分析结果表明，mDEGs与药物、花生四烯酸、酪氨酸和嘌呤代谢途径显著相关(图1C)。为了研究代谢变化是否与PCa的复发和进展有关，作者根据mDEGs的表达情况，用一致性聚类法将肿瘤组织分为3组不同的亚组（图1D，E）。三种代谢亚型的无病生存率(DFS)显示出显著差异（图 1F）。总的来说，这些结果表明肿瘤代谢重编程在 PCa 复发和进展中起重要作用。
首先，作者通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，以确定1186个mDEG的中枢基因。根据connection score，前100个中枢基因可能在PCa的进展中发挥更重要的作用（图2A）。KEGG分析结果表明，关键的mDEGs富集到突触通路、能量代谢通路(PI3K-AKT、MAPK和PARP)、药物代谢通路、胆固醇代谢通路、内分泌抵抗和类固醇激素生物合成通路，这些通路与前列腺癌的发展有关。GO分析表明这些mDEGs与类固醇和激素代谢过程、内质网腔、GTPase复合物和代谢物条带有关（图2B、C），这表明关键 mDEGs 在代谢和 PCa 进展中具有重要作用。然后采用单因素COX回归分析，筛选出与DFS相关的mDEGs。在前100个基因中，有25个基因与DFS显著相关，其中10个基因与危险因素相关，15个基因显示保护作用（图2D）。如图2E所示，大多数与生存相关的关键mDEGs相互关联，这表明PCa的代谢重编程是一个整体的变化，而不是单个基因的变化。
为了构建一个全面有效的代谢相关风险模型(MRM)来预测患者的预后，作者对DFS相关的关键mDEGs进行了Lasso Cox回归分析。交叉验证后，5个基因(APOE、AHSG、BGN、SLC2A4和CYP2D6)最为突出(图3A、B)。然后进行多因素COX回归分析，进一步验证独立的预后相关基因，并获得基因指数。如图3C所示，APOE、AHSG、BGN和CYP2D6是独立的危险因素，SLC2A4是独立的保护因素。然后作者根据这个模型计算MRS（代谢相关危险评分），并根据MRS的中位数将492例PCa患者分为high-MRS亚组(n=246)和low-MRS亚组(n=246)(图3D)。如图3E，F所示，high-MRS亚组的DFS率明显低于low-MRS亚组，表明high-MRS意味着更高的复发率。ROC曲线表明 MRM且具有良好的敏感性和特异性（图3G）。此外，ROC曲线显示MRM预测DFS的准确性优于其他临床参数(Gleason评分、前列腺特异性抗原(PSA)水平、TNM分期和年龄)(图3H)。此外，作者还探讨了MRS、临床特征和TCGA中PCa数据库中关键mDEGs表达水平之间的关系。图3I的热图显示APOE、BGN、AHSG和CYP2D6在high-MRS亚组的表达增加，而SLC2A4则相反。MRS与Gleason评分、TNM分期呈正相关，与PSA水平无关。单因素COX回归分析显示Gleason评分、PSA水平、T分期和MRS与PCa的DFS密切相关(图3J)，多因素COX回归分析发现MRS的p值最低，提示MRS可能是PCa最重要的独立预后指标(图3K)。因此，与目前使用的预后因素相比，MRM可能是预测PCa患者DFS的更好的指标。
为了验证模型的预后价值，经过筛选，作者选择在Taylor 和ICGC两个数据集验证MRM的可靠性，与TCGA数据库得出的结果类似，MRS越高的患者DFS时间或BCR时间越短，复发的可能性越大，预后也越差(图4A)。Taylor PCa队列中1、3和5年BCR的AUC值分别为0.75、0.73和0.69，ICGC PCA中的AUC值分别为0.82、0.85和0.80，表明MRM可能是预测PCa患者DFS的一个潜在临床特征，具有较高的准确性和可靠性(图4B)。此外，如图4C所示，由Taylor和ICGC PCa队列得出的ROC曲线表明，MRM的预测准确性最优。Taylor和ICGC队列的结果与TCGA的结果一致。在Taylor中，单因素和多因素Cox回归分析显示Gleason评分、PAS水平、T分期和MRS均与DFS密切相关，可作为PCa的独立预后指标(图4D)。在ICGC PCa队列中，单因素COX回归分析显示Gleason评分、T分期和MRS与DFS密切相关；多变量COX回归分析发现只有T分期和MRS是PCa的独立预后指标，但Gleason评分不是PCa的独立预后指标(图4e)，这可能与样本量、数据源的异质性和构成有关。因此，这些数据表明，在两个独立的PCA队列中，MRM是DFS或BCR的最佳独立预测因子。
接下来，作者使用郑州大学第一附属医院收集的组织来研究MRM在真是世界研究（RWS）的价值。如图4F所示，与正常前列腺组织相比，APOE、AHSG、BGN和CYP2D6在前列腺癌组织中显著上调，而SLC2A4则显示出相反的结果。进一步分析发现，MRS和pMRS（蛋白质水平的MRS）与Gleason评分和T分期密切相关，pMRS与N分期和分级呈正相关(图4G)。
首先，作者用GSEA来预测PCa TCGA队列中high-MRS组和low-MRS组之间的基因集变化。结果显示，high-MRS样本的基因富集在与增殖和细胞周期有关的通路上，而low-MRS样本富集到基因集则包含PCa下调和转移肿瘤下调的基因 (图5A)，这表明MRM亚组之间的肿瘤生长和转移存在显著差异。然后作者进行基因表达分析，通过比较high-和low-MRS组鉴定出1258个基因(图5B)。进一步研究发现，DEGs主要存在于多种代谢过程、跨膜转运体复合体和酶活性中(图5C)。KEGG分析还表明，这些DEGs与代谢途径密切相关，如PPAR信号通路、cAMP信号通路、类固醇激素生物合成、胆固醇代谢和药物代谢(图5D)。KEGG分析显示出具有代表性的代谢途径，特别是脂肪代谢和氨基酸代谢途径（图5E）。此外，GO和KEGG富集分析表明，DEGs还与突触、细胞外基质和细胞因子有关，这表明MRM与神经内分泌转化有关，并且不同亚群具有不同的微环境(图5C，D)。
TME是肿瘤细胞周围的微环境，包括免疫细胞、周围血管、成纤维细胞、细胞外基质和各种信号分子。首先，作者探讨了MRS和TME之间的关系。MRS与TME评分呈正相关，high-MRS组免疫细胞浸润和间质评分高于低MRS组(图6A)。high-MRS样本的基因组富集到免疫反应相关的通路 (图6B)。随后，作者进一步研究了MRS与PCa免疫细胞浸润的相关性，MRS相关的免疫环境的特征如图6C所示。作者筛选和收集了经典的免疫检查点，然后应用这些基因来定义不同MRS组之间的免疫和分子功能。结果发现，MRS与PDCD1、PDL1、CTLA4等30个免疫检查点的表达密切相关（Figure 6D）。值得注意的是，CTLA4和PDCD1的表达在高MRS样本中显著升高(图6E)，这表明免疫疗法可能是这些患者相对有效的治疗方法。另外，在预测免疫治疗反应方面，MRM的AUC值是临床特征中最高的(图6E)，表明这一新特征MRM可能是预测PCa患者免疫治疗反应的潜在指标。最后，作者进行了多重免疫荧光(mIF)检测出免疫检查点在PCa中的表达相对较弱，但high-MRS亚组的CTLA4和PDCD1表达均高于low-MRS亚组(图6F)。正如预测的那样，这些结果表明high-MRS亚组比low-MRS亚组更有可能从免疫治疗中受益。
作者假设不同MRS亚组的患者对药物的敏感性不同。作者通过KEGG富集分析发现内分泌治疗耐药、DNA修复基因、甲基化沉默和阿霉素耐药相关的通路与high-MRS相关，而药物反应相关的基因与低MRS呈正相关(图7A)。随后作者比较了高 MRS 组和低 MRS 组对常见抗癌药物的敏感性，以指导不同 PCa 患者的治疗选择。在标准药物选择方面，低 MRS 亚组患者对抗雄激素（阿比特龙）更敏感，而高 MRS 组患者对化疗（多西他赛和吉西他滨-顺铂（GC）化疗）更敏感（图 7B）。在推荐药物选择方面，低 MRS 亚组患者对 EGFR 抑制剂（如阿法替尼）、BI-2536（PLK1 和 BRD4）、HDAC 抑制剂（他西地那林）和 TGF-β 受体抑制剂（SB- 505124），而高 MRS 亚组的患者对 CDK 抑制剂（例如 AZD 5438）、PARP 抑制剂（例如 niraparib）和铁死亡激动剂（RSL3，erastin）更敏感（图 7C、D）
全文总结：
该文作者构建一个与代谢相关的基因图谱，来预测PCa的复发和治疗反应。并且作者还证明了它可以作为一种临床特征，更准确地评估预后，指导PCa患者选择合适的治疗方法。该方法在临床上也有进一步的应用前景。从思路上看，这篇文章是一篇经典的生信文章，而且在验证时也加入“湿”实验进行验证。这进一步提高分析思路的创新性和说服力，值得我们学习。
参考文献
1. Zhou L, Fan R, Luo Y, et al. A Metabolism-Related Gene Landscape Predicts Prostate Cancer Recurrence and Treatment Response. Front Immunol. 2022;13:837991.
