一、 Why：为什么要研究高深度测序数据中的测序错误，应用价值

过去报道的二代测序错误(主要是碱基替换)在0.1%左右。这个错误率对于检测低频突变来说，已经很高了。比如，肿瘤体系突变，就是典型低频突变的检测，在通过FDA 授权验证的MSKCC-IMPACT 研究中，热点突变位点检频率为0.02(2%)，非热点频率为5%，深度500–1000X。而目前市场上推广的各种肿瘤检测试剂盒(赛默飞世尔)，检测cfDNA，检测下线据称已达0.1%。由此可见，二代测序宣称的0.1%(Q30)的测序错误率相对于低频突变检测来说，已经不算低了。研究清楚错误来源，才好对症下药，降低错误率。

二、Where：测序错误来自哪些环节？

NGS样本处理流程的每一个环节，包括：样本处理，DNA分离，DNA聚合酶错误，PCR过程，测序过程等等。例如，5甲基胞嘧啶的自发脱氨基作用导致C>T/G>A 置换错误。如图：

深度靶向测序通常是基于扩增子和杂交捕获测序，潜在的错误在扩增过程中被放大。

三、测序错误评估过程（How）

数据来源及样本处理： 

研究目的：得到测序错误与低频体系突变的cutoff频率阈值。

Step1: 构建Benchmark数据集

对已知有19个somatic变异位点Cancer/Normal样本对，分别根据0.1%及0.02%的混样比例进行梯度Cancer/Normal混样，进行高深度测序，作为benchmark。 混样后，如果没有其他测序错误，对2个不同梯度测序数据，对比原始浓度为100%的Cancer/Normal数据，检测出来的变异频率MAF应该符合1000或5000倍的差距。混样后，不同混样浓度MAF比较见下图，图中红色标志为已知的18个Mutation，有且只有这18个点MAF比例基本符合前面推测，证明我们分析的target区域没有其它未知体系突变混杂。

下面特选了一个癌症样本体系突变SNV进行分析，这个SNV 位于chr1 q端，杂合缺失(LOH)，有4个拷贝(4倍体)，突变类型分别为：4v4, 2v4,1v4(突变占4份拷贝中的1分)，因此对于0.02%，0.1%不同浓度梯度的稀释样本，该体系突变的频率应当为: 0.01%, 0.02%, 0.04%, 0.05%, 0.1%, and 0.2%(注意原本正常胚系突变拷贝数为2)

Step2: 识别低质量Reads

1)Raw Reads -> Trim 首尾5bp，去除低质量序列

2)去除MAPQ低的序列

3)评估剩余"高质量"(按常规流程看来，这已经算是经过过滤的高质量序列了)Reads的整体Reads质量和错误率。PS: 这里整体Reads质量为Reads中质量低于20(也就是错误率>%1)的碱基的数目。

结果见下图：

a为3种不同试验碱基质量分布图，蓝线为累计分布。横坐标为碱基质量值，纵坐标为碱基比例。

b为Reads上不同位置碱基质量分布图，横坐标为碱基位置，纵坐标为质量值为Q30+的碱基比例

c为Reads MPAQ累计分布图，黑色箭头为MAPQ filter的cutoff值(30和55)。横坐标为MAPQ，纵坐标为reads比例。

d展示了低质量Reads的比例。横坐标为Reads中低质量碱基数目，左纵坐标为Reads数目，右为对应的错误率。图h，黄线显示错误率并没有随着Reads质量的提高而降低，这可能是因为C>T/G>A测序错误，因为移除这类错误之后，结果基本呈现负相关，见紫色线。

4)由此开发了一个工具--CleanDeepSeq进行allele count，它会在进行等位计数(allele count)之前，进行低质量Reads去除

Step3: 与标准mutation caller对比

1)见图：

图a:红色表示A>T erro，灰色表示其它erro。从图a可以看出，作者的CleanDeepSeq很高效地降低了A>T erro(20倍)，使目标(已知)变异BRAF-V600E轻易与背景噪音分离开来。

图b/C:2个不同浓度梯度，样本水平，CleanDeepSeq流程与常规流程比较，横坐标为log10(erro rate)，左纵坐标为log10(Median erro rate)，右为样本数。红点表示前文所说已知体系突变的MAF，3种颜色(红蓝黑)分别代表3钟突变类型(1v4,2v4,4v4),

从图中可以看出，不同的替代类型错误率不同。C>T/G>A错误率最高(可能是5甲基胞嘧啶脱氨基作用)。并且，CleanDeepSeq也无法有效将C>T/G>A变异与测序错误区分，而C>T/G>A也是癌症中的常见变异。

2)C>T/G>A测序错误signature分析

C>T/G>A测序错误依赖其上下序列组成。

上图，C>T/G>A测序错误根据上文序列的类型不同，分解出16种不同结果。*表示在该序列环境下，C>T/G>A测序错误比例上升。可以看出当，出现在GN,NG,GG环境中时，错误率上升。

Step4: 不同测序中心，测序平台及DNA聚合酶的比较

Step5:癌症相关替换及热点替换错误率

发现近30% COSMIC Somatic SNV处在高测序错误率环境(容易与同类型的测序错误混淆)。这意味着还有70%的Somatic SNV是低测序错误率环境，通过高深度测序，可以检出这样的低频突变(0.01~0.1%)。而热点突变，70+%是低测序错误率环境，因此通过高深度测序，也可以在0.001~0.1%水平上检出。

Step6:由样本处理及存储带来的错误替换

样本特异的DNA损伤也可以带来错误。

图a-d，每列代表一个样本(共47 leukemia samples),一行代表一个在所有样本中都测到的位点。一共分成4(4种可能碱基类型)类突变类型(panel)，对于每一类，根据位点错误类型(3种)对样本进行cluster。可以发现在sample水平，哪些样本有明显的C>A及G>T突变。图e,表示样本特异错误与C>T/G>A和C>G/G>C这2类错误的相关关系，可以看出明显正相关，线性回归模型和R2值如图所示。

Step7: 为CleanDeepSeq打call

使用标准流程，错误率为~0.1%，用CleanDeepSeq后，10倍降低错误率。见图：

Step8:两轮富集PCR错误

WGS数据：1轮PCR

杂交捕获数据：2轮PCR(6~18cycles)

捕获数据的错误率比WGS高5.5~6.5倍

左图99th分位数，右图99.9th分位数

四、总结

本文主要讲了几种测序错误来源，发现测序错误有不同的替换类型并且对上下游环境有依赖，反应了DNA聚合酶的忠实性(在人为的测序过程中与在生物体内机制，比如cancer，错误偏好一样)。此外，还通过部分样本某一类测序错误的富集，揭示了这些样本在处理及存储上发生问题。作者开发的工具CleanDeepSeq在降低测序错误率的同时，在call Mutation时可以降低3~30倍的假阳性率，特别对单样本，没有对照的变异检测很有帮助。

更多生信分析套路，请加微信13621202201

TCGA | 小工具 | 数据库 |组装| 注释 |   基因家族  |  Pvalue

基因预测  |bestorf |  sci | NAR | 在线工具 | 生存分析 | 热图

 生信不死 | 初学者 | circRNA | 一箭画心| 十二生肖 | circos

 舞台|基因组 | 黄金测序 | 套路 | 杂谈组装 |  进化 | 测序简史