颅咽管瘤(Craniopharyngioma,CP)是一种组织学上良性但临床上十分具有挑战性的肿瘤。今天小编要和大家介绍的是一篇21年12月刚刚发表在Molecular Cancer（IF:27.401）杂志上的全基因组测序（WGS）CP分析突变的文章。分析突变的文章有很多，但这篇文章影响因子却达到了27+，相信小伙伴们也很好奇这篇工作的内容。接下来就让小编带大家看看这篇高分文章的庐山真面目吧，小伙伴们不要错过这个高分思路呀。

Characterization of novel CTNNB1 mutation in Craniopharyngioma by whole-genome sequencing

全基因组测序刻画颅咽管瘤中CTNNB1突变

一．研究背景

颅咽管瘤(CP)是一种少见的原发良性脑肿瘤，与视神经、下丘脑、颈内动脉等重要功能结构毗邻，因此临床治疗十分具有挑战性。此外，CP可分为两个主要的组织学亚型:ACP和PCP。先前已经有研究揭示了这两类肿瘤都存在一些基因组上的畸变，但目前为止，该肿瘤基因改变的完整谱系仍然是未知的。因此今天分享的文章就对CP进行了全基因组测序，进而对突变进行了全面刻画。

二．数据及方法

1. 临床样本：研究纳入2014年1月至2015年7月华西医院组织学诊断为颅咽管瘤的26例患者（CPs）包括16例ACP和10例PCP患者，也收集了这些样本的年龄和性别。

2. 全基因组测序（WGS）：研究对样本进行了全基因组测序，将DNA剪切至300-400bp的大小并对DNA片段纯化，测定测序文库的DNA浓度，分析测序文库的数量和大小，最后进行聚类及对端测序。

3. 数据处理及体细胞突变检测：针对WGS结果，研究将原始reads转化为FASTQ，然后用BWA-MEM算法与人类参考基因组(hg19)进行比对。使用基因组分析工具包(GATK 3.8)进行重复reads去除、局部重组和基础质量调整。碱基替换由muttect2和Strelka2分析，而缺失由Strelka2和Varscan2分析。然后利用正常血液样本WGS数据构建的基因座背景对得到的初始体细胞变异集进行筛选，其中低复杂度区域(如串联重复序列区域)的突变被过滤掉。最后，Mutect2的体细胞变异都被保留，而只在Strelka2或Varscan2 的体细胞变异被过滤，体细胞重排用Manta分析。然后使用IGV观测重排，去除假阳性事件。用Sequenza评估肿瘤纯度和倍性。

4. Kataegis分析：文章用regioneR和karyoploteR两个R包对全部小突变进行Kataegis分析，用指定颜色绘制不同类型的突变。

5. 突变特征分析：用DeconstructSigs分析突变特征。先前在成人和儿童脑癌中识别和验证了COSMIC特征1/5/6/11/14和1/5/8。文章首先计算了这6个突变特征对每个样本的相对贡献。此外，由于之前没有对CP 进行过WGS分析，因此作者将30个COSMIC特征全部考虑在内，计算它们对CP的贡献。

6. 实验分析：原代细胞培养、细胞培养和病毒制备、RT-qPCR、蛋白免疫印迹、免疫沉淀反应(IP)分析、CCK-8实验、克隆形成实验、免疫组化、荧光原位杂交。

三．研究的主要内容及结果

1. CP基因组的体细胞突变总述

在文章的第一部分作者对CP基因组的体细胞突变总体刻画。研究共对26个CPs进行了全基因组测序，最终检测到20772个体细胞突变，包括SNVs(单核苷酸变异)和InDels(插入和缺失)，平均每个患者有760个SNVs和39个InDels(图1a)。与其他类型肿瘤相比，CPs中肿瘤突变负荷（TMB）相对较低，与其组织良性一致，且突变大多发生在基因间区，其次是内含子区(图1b和c)。而只有243个体细胞突变发生在211个基因的编码区域内(图1d)。对所有体细胞SNV和InDels的kataegis分析表明，突变倾向于发生在染色体末端(图1e)。此外，作者也发现CP基因组的染色体末端的频繁体细胞突变更靠近端粒区。这表明即使在良性肿瘤中，靠近端粒的区域也容易受到DNA损伤。

2. 突变谱与特征

在文章的第二部分作者对CPs进行了全基因组突变谱分析，发现C:G>T:A转换和T:A>C:G转换是队列中的主要替换(图2a和b)。接着作者使用deconstructSigs分析队列的突变特征，先前在成人和儿童脑癌中识别和验证了COSMIC特征1/5/6/11/14和1/5/8。文章首先计算了这6个突变特征对每个样本的相对贡献。结果从图2c中可以看出，除了特征14外，这些特征对CPs的突变过程贡献很大，而特征5对CPs的贡献最大。此外，年龄相关特征1也在22个CPs中被发现（图2d）。

3. 蛋白质编码区的体细胞突变

在这一部分，作者分析了蛋白质编码区的体细胞突变。在211个蛋白编码区突变的基因中，在至少2个患者或COSMIC Cancer Gene Census中列出的突变基因如图3a所示，其中与之前的报道一致，CTNNB1突变和BRAF V600E突变在ACP和PCP中互斥。作者也发现16个ACPs中有11个在CTNNB1基因外显子3发生突变(图3b)。此外，在PCPs中，10例患者中有7例检测出BRAF V600E突变(图3a)。作者也在CP33中发现了FBXW7 WD40结构域内的一个新的无意义突变。为了验证这一点，作者采用FISH技术检测患者FBXW7 mRNA水平。如图3c所示，CP33中FBXW7的mRNA水平确实低于CP12 FBXW7-wilt型的水平，说明这种突变的mRNA可以被NMD降解。

4. CTNNB1 - Mut增加β -catenin蛋白稳定性

如上所述作者从WGS结果中发现患者CP111的CTNNB1外显子3 有一个新的突变(图3b)， 且Sanger测序进一步证实了这一点（图4a）。该突变包括39个核苷酸的缺失和一个错义替换，从而导致13个氨基酸残基缺失和p.A43G的改变(图4a)。因此，在这一部分作者进行了实验验证及探索突变的生物机制。由于制备人ACP原代细胞比较困难，且没有可用的ACP培养细胞，作者首先选择HEK293T(正常细胞)和HCT116细胞(结直肠癌细胞)进行研究。为了防止内源性β-catenin对突变体功能的影响，在HEK293T和HCT116细胞中，内源性β-catenin被短发夹RNA (shRNA)敲掉(图4b)。然后作者在β-catenin敲除细胞中建立表达耐shRNA的野生型或β-catenin突变型细胞系，分别命名为CTNNB1-WT或CTNNB1-Mut细胞。结果观察到CTNNB1- Mut细胞的β-catenin水平高于CTNNB1- WT细胞(图4c)。β-catenin的增加可能是由于其mRNA或蛋白稳定性的改变引起的。为了验证这一点，作者用放线菌素D处理HEK293T及HCT116稳定细胞，终止不同时间的基因转录，然后测量β-catenin mRNA水平。结果表明，WT与突变体β-catenin mRNA的半衰期没有显著差异，说明该突变体对其mRNA的稳定性没有影响。接下来，作者在不同时间用蛋白质合成抑制剂CHX处理细胞，然后进行蛋白免疫印迹检测其蛋白质稳定性。如图4d所示，CTNNB1- Mut细胞对β-catenin的降解比WT细胞慢，这表明CTNNB1的这种新突变增加了β-catenin的稳定性。由于这种新的CTNNB1突变导致了CK1α磷酸化的Ser45残基丢失，所以突变β-catenin的Ser45磷酸化状态几乎没有检测到(图4e)。考虑到Ser45磷酸化对β-catenin的多聚泛素化和随后的蛋白酶体降解至关重要，作者用免疫沉淀野生型或突变型β-catenin来检测其泛素化状态。结果发现突变体β-catenin的多聚泛素化显著低于野生型(图4f)。因此作者推测这种新的CTNNB1缺失突变通过泛素化-蛋白酶体系统破坏β-catenin蛋白的降解，从而增加β-catenin蛋白的水平。

5. CTNNB1 - Mut促进Wnt/β - catenin信号通路

先前研究已经发现积累的胞质β-catenin会易位到细胞核与T细胞因子及淋巴增强结合因子(TCF/ LEF)转录因子相关，进而促进Wnt靶基因的转录。在这一部分作者为了确定CTNNB1-Mut是否具有转录活性，进行了TCF/LEF反应荧光素酶检测来实验验证。结果显示，无论是CTNNB1- Mut还是CTNNB1- WT都能刺激HEK293T细胞(图4g)和HCT116细胞(图4h)的TOP-FLASH转录，说明这个β-catenin突变仍然保持其转录功能。由于CTNNB1-Mut通过延长其蛋白半衰期来增加β-catenin的表达(图4d)，因此CTNNB1-Mut的活性升高在两种细胞中均远高于CTNNB1-WT(图4g和h)。此外，作者也检测了Wnt/β-catenin靶基因如c-Myc和SOX9的表达水平。结果发现，与CTNNB1-WT组相比，CTNNB1-Mut细胞中c-Myc和SOX9的表达显著升高(图4i)。因此，本研究中发现的CTNNB1突变使其蛋白稳定，从而增强其下游靶点的表达。

6. CTNNB1 - Mut通过激活Wnt信号通路促进ACP原代细胞增殖

在文章的最后一部分，作者为了进一步探索CTNNB1-Mut在ACP背景下的功能，制备了ACP原代细胞，并比较了野生型和突变型β-catenin的表达。结果与HEK293T和HCT116细胞的结果相同，与野生型相比，这种CTNNB1突变导致了更长的半衰期和更高的β-catenin蛋白水平(图5a和b)。此外，在MG132处理的原代细胞中，野生型β-catenin的蛋白丰度增加，而突变型β-catenin没有出现这种现象，表明突变型的降解通路受损(图5c)。同时，作者也进一步验证了突变体β-catenin的Ser45磷酸化和泛素化水平在ACP原代细胞中均显著降低(图5d和e)，这与之前的结果一致(图4e和f)。免疫组化分析也发现，在CTNNB1突变的ACP样本(CP111)中明显观察到β-catenin的核免疫阳性，而在没有CTNNB1突变的ACP样本(CP121)中几乎不存在(图5f)。此外，突变体β-catenin还在ACP原代细胞中激活其已知靶基因(c-Myc和SOX9)转录，从而导致其mRNA(图5g)和蛋白水平(图5h)的升高。为了研究CTNNB1-Mut对ACP肿瘤发生的影响，作者进行了CCK-8和菌落形成实验。结果如图5i和j所示，突变体β-catenin显著促进ACP原代细胞增殖。综上所述，这些结果证明CTNNB1-Mut可能通过激活Wnt/β-catenin信号ing通路促进ACP的发生。

到这里这篇文章的主要内容就介绍完了，文章的方法并不复杂，但有理有据，从全基因组测序数据入手，用生物信息学方法多角度分析了突变，并对重要结果进行了实验验证。纵观全文，逻辑清晰，条理明确。如果小伙伴们测序数据有了，却没思路的不妨看看这篇文章，其分析角度及叙述方法非常值得我们参考学习。

参考文献

1. Characterization of novel CTNNB1 mutation in Craniopharyngioma by whole-genome sequencing;