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在上一篇文章(热点剖析：免疫细胞代谢研究—不看后悔系列)中说到，本小编接下来想避开单细胞测序来写东西了，要不然一直做单细胞测序的解读会有点油腻。其实如今每年都有许多新技术的出现，但大多只是适用于某一个研究领域或者说某一些领域，因此像单细胞测序这样影响力大、适用性强的技术真的是少之又少。既然说少，肯定还是有滴，那么今天咱们不说三国，也不说水浒，就来说一款可以和单细胞测序叫板的技术——质谱流式技术。
还记得小编第一次接触它是来源于一张图(图1)，作为一个还算可以的单细胞测序数据分析的玩家，小编一看就觉得这是一张基于单细胞测序数据做出的图，以至于当时觉得图例说什么流式技术是写错了。后来通读了全文后发现，还是自己孤陋寡闻了，它果然是一种叫做质谱流式技术的产物。
图1：
首先呢，普及一下质谱流式的基础知识。质谱流式技术是近来年发明的一门新兴技术，它利用金属同位素标签替代荧光标签，并利用质谱对标签进行定量，通过结合质谱和流式细胞技术，可以同时对单细胞进行超多参数、无需补偿的测量，大大增强了评估复杂细胞系统和过程的能力，弥补了荧光流式的不足。其高通量、高灵敏度和高稳定性的特点尤其适合于免疫、肿瘤、血液、药物和遗传学等学科的研究中。
质谱流式技术从最开始投入到科研到现在也有一些年头了，运用的也越来越广泛。如果说普通的流式技术是免疫学的灵魂，那么质谱流式技术就相当于给免疫学加了血肉之躯，使得免疫学在整个生命领域的作用越来越重要(有专业自吹的嫌疑)。当然小编说这话得有所依据，不能仅凭自己平时阅读文献老是碰到它，要不然很容易啪啪打脸，于是简单去谷歌了一下，还真不少。那么就简单列出几篇高分文章吧，只有这样才算有理有据，于是先整上一套CNS（图2）。
图2：
好了，讲到这大家也知道你点进来看是对了，但小编写文章一直追求是要给读者带来一些不一样的收获，但上面哪篇文章做的内容都比较复杂，不好下嘴，大家读起来也不太容易理解，于是下面就挑了两篇影响因子稍微低一点的文章进行解读。
第一篇是今年发表在immunity(IF:31.7)的一篇文章，篇名是“Single-cell analysis by mass cytometry reveals metabolic states of early-activated CD8+ T cells during the primary immune response”。从篇名就可以看出这是一篇研究肿瘤微环境中免疫细胞代谢的文章，通过标志代谢相关蛋白的质谱流式技术揭示初始免疫应答下CD8+ T细胞的代谢模式。
1.用质谱流式监测细胞代谢模式的可行性
从第一张图我们就可以看出，作者应该是性情中人，怕读者看不懂后面的流程，先给普及一下CD8+ T细胞的调控网络和关键标志蛋白(图3).这两张图乍一看是挺复杂的，各种信号的受配体以及调控代谢的关键基因共同维持着CD8+ T细胞的正常功能。其实简单来说就是CD8+ T细胞在被抗原刺激活化后，由TCR信号介导的一系列由外向内的调控网络，表现为在不同细胞状态下膜表面相关蛋白的高表达。同时也是为了告诉读者，可以通过检测关键蛋白的表达来揭示CD8+ T细胞的代谢状态，不同的代谢状态也预示着细胞的不同功能，二者是相辅相成的。
图3：
如果只是检测某几个蛋白，普通的流式细胞术就能满足需要，但是由于细胞的代谢流变化迅速且牵涉较多的代谢调控基因和酶，那普通的流式就显得有心无力了。于是，主角登场，质谱流式它来了。相较于普通的流式细胞术，质谱流式可以最多同时检测100种胞内和胞外蛋白。同时，因为是使用重金属作为标记物，大大降低了光谱流式细胞术每段光波之间补偿较大的问题，于是能更清楚的区别各种细胞亚群。
2. 质谱流式揭示单个CD8+ T细胞代谢表型及调控因子
为了从生理学的角度探索CD8+ T细胞分化期间的代谢变化，研究人员利用Lm-OVA(一种细菌)感染C57BL/6小鼠评估了体内急性感染反应的轨迹，该分析揭示了在对单核细胞增生李斯特菌的主要免疫应答过程中，所有主要典型T细胞亚群的异质性和动态功能变化。接下来通过使用标记40种蛋白，对各个状态下的CD8 T细胞进行标记，并基于tSNE算法绘制出全文最炫的一张图(图4)，有点像一个斧子，区分度一点不比单细胞测序的数据差。
图4：
研究发现，大多数幼稚细胞都包括Naïve 1细胞亚群，主要表现为较低表达的ACADM、 pCREB、 p-p38和 NRF1。在感染的前两天，三种幼稚细胞都有表达。在感染的第四天，Naïve 4细胞亚群开始表达。值得注意的是，从感染6天及之后，Naïve 1细胞亚群占比开始升高成为主要的幼稚细胞亚群，其他三种细胞幼稚细胞表达退化。该结果揭示了这些细胞所承担的代谢适应性，并验证了幼稚T细胞的新陈代谢静息图谱。
第一张图主要是对naïve T细胞的代谢模式进行揭示，下面就是分别对其它类型的CD8+ T细胞进行研究，感兴趣的小伙伴可以去看看原文，小编这里就略过了。下面直接讲全文的另一大亮点，设计CAR T研究了抗原特异性 T 细胞在人体免疫反应过程中的代谢动力学。
3.对恶性肿瘤反应的CAR T细胞代谢动力学
研究发现在输注细胞后，采用转移的CAR T细胞表现出与小鼠早期活化T细胞类似的代谢动力学，具有高峰氧化和糖酵解相关蛋白的表达。而在治疗后7天，大多数代谢蛋白质表达减少。 另外，值得注意的是，相关性分析表明在输注时氧化磷酸化和糖酵解蛋白之间存在正相关，这表明这些过程并不是互相排斥的。此外，与感染小鼠感染模型一致，在这种早期激活状态下，ICOS也是CD8+ CAR T细胞高表达的关键标志蛋白。
图5：
下面总结一下，这项研究采用了质谱流式细胞技术，在单细胞分辨率下量化代谢相关调节因子的同时，进行细胞信号转导、增殖以及效应功能的研究。研究揭示了早期活化T细胞独特的代谢状态，其特征在于糖酵解和氧化代谢蛋白的最大程度表达。特别是在感染后5天，处于这种瞬时状态的细胞最为丰富，随后代谢相关蛋白迅速降低。研究人员在晚期淋巴瘤患者的CAR T细胞中观察到类似的结果。该研究证明了通过质谱流式来进行单细胞代谢分析，以在体内识别免疫细胞亚群的代谢适应实用性，并为研究各种应用中免疫应答的代谢调节提供了参考。
4.质谱流式探索晚期肝癌综合免疫学特征
上一篇讲的是今年刚发表的比较有研究意义的一篇基于质谱流式的研究文章，今年还有很多类似的文章，但更多的是将质谱流式运用到其中一个环节。既然篇名为高分文章简单做，那下面就要讲一篇简单到不能再简单，设计也很通俗易懂的文章。
第二篇文章解读的是2020年发表在J Immunother Cancer(IF:13.7),篇名为“Integrated immunological analysis of a successful conversion of locally advanced hepatocellular carcinoma to resectability with neoadjuvant therapy”。如何简单呢，全文就四张图，而且就只做了一个事情：利用质谱流式技术和成像质谱流式技术，对治疗后的手术切除肿瘤样本和治疗前后的血液样本进行了综合免疫分析。全文可以说没有任何设计可言，也很通俗易懂，感兴趣的小伙伴可以下载原文放一下，同样小编也放一张很美观的一张图(图6)，主要是左半边哈。
图6：
这项研究结果表明，联合新辅助治疗可导致免疫细胞的成功募集，淋系细胞和髓样细胞彼此间或与间质细胞间的共浸润是以一种非随机的、协调的方式发生的。研究人员计划在这个正在进行的试验中，用同样的质谱流式和IMC联合方法对每一位患者进行分析，以推动进一步的研究发现。
5.小结
就像最开始流式细胞术还没有普及的时候，有一些实验室随便用流式检测一些细胞的表面蛋白就能发表不错的文章，如今的质谱流式技术仍然处在这样的一个红利期。但是目前它的价格还是比较昂贵的，大概5千左右一个样品，一般需要3个生物重复，因为要用到很多针对不同蛋白的抗体，所以这个费用短期内不会降下来。从这方面讲，这项技术就对一般实验室的科研人员不太友好，但是，但是，悄咪咪告诉你，质谱流式数据也是可以挖掘的。
和单细胞数据一样，一般杂志在接收之前碰到做质谱流式的文章，都是要求把数据传到数据库中。因此只要有相关领域的文章做过质谱流式，那完全是可以把数据下载下来支持自己的研究的。分别推荐大家一个网站(http://flowrepository.org)和一个包(CytofWorkflow)，这是用来下载质谱流式数据的网站和分析质谱流式数据的R包，大家赶紧用起来吧！！
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2. Rendeiro AF, Ravichandran H, Bram Y, Chandar V, Kim J, Meydan C, Park J, Foox J, Hether T, Warren S, Kim Y, Reeves J, Salvatore S, Mason CE, Swanson EC, Borczuk AC, Elemento O, Schwartz RE. The spatial landscape of lung pathology during COVID-19 progression. Nature. 2021 May;593(7860):564-569. doi: 10.1038/s41586-021-03475-6.
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