Aging. 2019 Feb 28; 11(4): 1204–1225 . IF=5.179

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m6A RNA甲基化调节因子可调控神经胶质瘤的恶性发展及影响其临床预后

result1:  m6A RNA甲基化调节因子的表达与胶质瘤中的临床病理学特征相关

result2:  m6A RNA甲基化调节因子的一致性聚类鉴定出两组胶质瘤，且两组具有不同

临床结果和临床病理特征

result3： 通过一致性聚类鉴定的类别与神经胶质瘤的恶性程度密切相关

result4： m6A RNA甲基化调节因子的预后价值，以及使用七种选定的m6A RNA甲基化调节因子构建的风险特征

result5： 预后风险评分显示与胶质瘤的临床病理学特征密切相关

背景知识

胶质瘤的WHO分级：分为4级，1级恶性程度最低，预后最好，4级为胶质母细胞瘤，恶性程度最高，预后最差。

针对甲基化过程中不同参与角色的m6A RNA甲基化调节因子

writers（甲基转移酶）-METTL3 , METTL14 , WTAP , KIAA1429 , RBM15 , ZC3H13

readers（结合蛋白）-YTHDC1 , YTHDC2 , YTHDF1 , YTHDF2 , HNRNPC

erasers（去甲基化酶）-FTO , ALKBH5

文章中提到的

ＴＭＺ：替莫唑胺（Tｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）是一种口服烷化剂，能穿过血脑屏障直达病灶，是临床上化疗脑胶质瘤的一线常用药物之一。 

IDH：异柠檬酸脱氢酶，具有重要脱羧作用的氧化还原酶，已有研究表明胶质瘤患者中IDH突变型相对于野生型，具有更好的预后。

1p/19q codeletion：指1号染色体短臂和19号染色体长臂同时缺失，1p/19q联合缺失在少突胶质瘤中常见。

上皮-间质转化（EMT）：指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质细胞表型的生物学过程。EMT是恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，是肿瘤侵袭和转移的关键步骤。

研究数据：

the Chinese Glioma Genome Atlas (CGGA) (n = 309)

the Cancer Genome Atlas (TCGA) (n = 595)

RNA-seq转录组数据（13个m6A RNA甲基化调节因子的表达值）及临床病理特征数据

研究方法：

Consensus Cluster --  样本分亚型（RM1 / RM2）

Cox regression analyses （univariate / multivariate） -- 寻找预后相关因子

gene set enrichment analysis (GSEA)  --寻找与不同胶质瘤亚组相关的功能（基因集）

研究结论：

1、 13个主要的m6A RNA甲基化调节因子在不同临床病理学特征样本中存在差异表达，一致性聚类分析可将904个胶质瘤样本分为2个亚组（RM1/2） 。

2、相比于RM1，RM2具有更差的预后、更高的WHO分级、更低的IDH突变频率。而且基因集富集分析发现：上皮-间质转化及肿瘤坏死因子通过NF-κB途径传播信号等功能过程均显著富集于RM2。这表明m6A RNA甲基化调节因子与恶性胶质瘤密切相关。

3、基于以上发现，我们使用cox回归从13个m6A RNA甲基化酶调节因子挑选得7 个作为风险特征，该风险特征不仅是一个独立的预后标志物，还可以预测胶质瘤的临床病理特征。

4、另，m6A RNA甲基化调节因子还与恶性胶质瘤中的间充质亚型和TMZ敏感性有关。总之，m6A RNA甲基化调节因子是胶质瘤恶化的重要参与者，可能对预后分层和改善治疗策略有用。

研究过程

m6A RNA甲基化调节因子的表达与胶质瘤中的临床病理学特征相关。考虑到每种m6A RNA甲基化调节因子在肿瘤的发生和发展中的重要生物学功能，作者系统地研究了每个单独的m6A RNA甲基化调节因子与胶质瘤的病理特征之间的关系，包括WHO等级，IDH状态和1p / 19q联合缺失状态。每个m6A RNA甲基化调节因子的表达水平与WHO分级以热图展示（图1A,B），大多数调节因子与WHO分级显著相关。在CGGA数据集（图1C）和TCGA数据集（图1D）中，通过定量分析也证实了WHO分级与WTAP、RBM15、YTHDF、ALBKH5和FTO的表达水平显著相关。随着WHO等级的升高，WTAP、RBM15、YTHDF和ALBKH5的表达增加，而FTO的表达减少。

然后作者分别分析了在低级别胶质瘤（LGG，图1E,F）和胶质母细胞瘤（GBM，图1G）中每个m6A RNA甲基化调节因子的表达水平与IDH状态的关系。结果显示， ALKBH5、YTHDF2、RBM15、METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1的表达水平在LGG的 IDH突变型和野生型间显著差异，CGGA和TCGA两数据集中结果一致。在CGGA数据集中，FTO、YTHDC1和METTL3的表达水平在GBM的IDH突变型和野生型间显著差异（图1G）。然而在TCGA数据集中，GBM的IDH突变型（n=10）和IDH野生型（n=139）样本量显著不平衡，所以无法进行相应比较。在LGG的IDH突变型中，作者发现YTHDF2和WTAP的表达水平与1p / 19q联合缺失高度相关（图1H）。 

图1-不同病理学特征的胶质瘤中m6A RNA甲基化调节因子的表达情况

m6A RNA甲基化调节因子的一致性聚类鉴定出两组胶质瘤，且两组具有不同临床结果和临床病理特征。基于m6A RNA 甲基化调节因子的表达相似性，对样本进行一致性聚类。通过图2A,B判断，样本分为3组（K=3）似乎更合适，但3组中的最小组样本非常少（图2C），故最终取K=2。比较两个亚组的临床病理学特征（图2C），RM1亚组与诊断时较小的年龄（P <0.0001），胶质瘤低级别（P <0.0001），原神经细胞型或神经元型（P <0.0001），IDH突变状态（P <0.0001）和1p / 19q联合缺失（P <0.0001）显著相关。而RM2亚群多数胶质瘤样本特点为诊断时年龄较大，胶质母细胞瘤（GBM），经典或间质亚型，IDH 为野生型和1P / 19q非联合缺失。此外，我们观察到RM2亚组的总生存期（OS）显著短于RM1亚组（图2D）。

图2-RM1 / 2亚组中胶质瘤的临床病理特征和总体存活率不同

通过一致性聚类鉴定的类别与神经胶质瘤的恶性程度密切相关。上述研究结果表明，聚类结果与胶质瘤的恶性程度密切相关。为了更好地理解13个m6A RNA甲基化调节因子之间的相互作用，作者对它们之间的相互作用（图3A）和表达相关性（图3B）进行了分析。WTAP似乎是'writer'的中枢基因，它与METTL3，METTL14，KIAA1429和ZC3H13的相互作用或共表达。WTAP的表达也与胶质瘤中METTL14，KIAA1429和RBM15的“writer”显着相关（图3B））。“writer”中有几个独立的相互作用群体，表明不同“writer”的不同功能（图3A）。详细关系见图。作者进一步使用主成分分析（PCA）比较了RM1和RM2亚组之间的转录谱。结果显示它们之间有明显的区别（图3C）。我们鉴定出RM2亚组中显著上调或下调的基因，然后使用GO进行功能注释（图3D）。结果表明，上调的基因富集于恶性肿瘤相关的生物过程，包括细胞增殖，细胞外基质组织，血管生成，迁移和免疫应答等。在KEGG功能通路注释中也观察到相应信号传导途径的类似变化（图3E）。此外，基因集富集分析（GSEA）揭示了肿瘤的恶性标志与RM2亚组显著相关，包括上皮 - 间质转化，通过NF-κB的TNFα信号传导，炎症反应和IL6 / JAK / STAT3信号传导（图3F））。所有这些发现表明，通过一致性聚类鉴定的两个类别与神经胶质瘤的恶性程度密切相关。

图3- m6A RNA甲基化调节因子间的相互作用及RM1 / 2亚群胶质瘤相关功能富集

m6A RNA甲基化调节因子的预后价值，以及使用七种选定的m6A RNA甲基化调节因子构建的风险特征。

图4-风险特征

接下来研究m6A RNA甲基化调节因子在神经胶质瘤中的预后作用。对CGGA数据集进行单变量Cox回归分析（图4A）。结果表明，13个测试基因中有11个与OS显着相关（P <0.05）。将LASSO Cox回归算法应用于CGGA数据集中的11个预后相关基因，选择7个基因建立风险特征（图.4A），并且使用从LASSO算法获得的系数来计算训练数据集（CGGA）和验证数据集（TCGA）的风险评分。为了研究七基因风险特征的预后作用，我们根据风险评分中位数将CGGA（n = 309）和TCGA（n = 595）数据集中的胶质瘤患者分为低风险和高风险组，发现两个类别之间OS差异显著（P <0.0001; 图4B，C）。

预后风险评分显示与胶质瘤的临床病理学特征密切相。热图显示七个选择的m6ARNA甲基化调节因子在CGGA数据集高危和低危患者中的表达（图5A）。

图5-风险评分，临床病理特征与RM1 / 2亚组之间的关系

我们观察到高风险组和低风险组之间在WHO分级，年龄，IDH状态，1p / 19q 联合缺失状态，TCGA亚型和RM1 / 2亚组方面存在显着差异。检查风险评分与每个临床病理特征之间的关联，发现不同的WHO分级，TCGA亚型，年龄，IDH状态，1p / 19q联合缺失状态和RM1 / 2亚组的风险评分存在显著差异（图5B-H））。ROC曲线表明，风险评分可以完美预测胶质瘤患者三年生存率，RM1/ 2亚组，神经胶质瘤IDH -mutant状态和神经胶质瘤1p / 19q联合缺失状态。且预测效率优于WHO分级和年龄（图5I-L）。这些结果表明，用特征计算的风险评分可以准确预测胶质瘤患者的预后和临床病理特征。然后作者对CGGA数据集进行了单变量和多变量Cox回归分析，结果证实，来自m6A RNA甲基化调节因子的风险评分可以独立地预测胶质瘤患者的预后（图5M,N）。

图6-WHO分级的患者的风险特征的预后价值

最后作者确定了风险特征对不同WHO等级的的预后值。发现具有高风险评分的患者的OS显著短于评分低的患者（含WHO II级和III级神经胶质瘤（图6A，B）和GBM（图6C））。此外，风险评分还可以预测CGGA（图6D）和TCGA数据集（图6E）GBM中的间充质亚型。与此发现一致的是，对于CGGA和TCGA数据集GBM患者，具有高风险评分的，TMZ治疗也更敏感（图6F-I）。

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