EBioMedicine|肝癌免疫抑制和基因组改变机制
生信干货
Leyla ·2020年3月25日 02:25
今天跟大家分享的是二月份发表在EBioMedicine（IF：6.68）杂志上的一篇文章Classification of primary liver cancer with immunosuppression mechanisms and correlation with genomic alterations。作者基于转录组和全基因组测序数据对肝癌患者进行了免疫基因组分析，进一步的对炎症性和非炎症性肝癌进行分型，发现亚型与预后，分子亚型和体细胞改变等因素相关，说明肝癌临床样本中肿瘤微环境的异质性。Classification of primary liver cancer with immunosuppression mechanisms and correlation with genomic alterations肝癌在免疫学和遗传学上是高度异质性的，对肝癌微环境进行更细致的分类可以提高我们对其免疫多样性和对免疫治疗反应的认识。其肿瘤微环境（TME）分为炎症性和非炎症性肿瘤，炎症性的预后较好，但是目前还不清楚这种反应是否与炎症性的TME相关。相关研究显示某些肝癌组织中Tregs与CD4+或CD8+ T细胞的比值较高，肿瘤的预后较差。所以本工作意图根据肝癌之间的这种免疫异质性对肝癌免疫微环境进行更细致的分类，其与基因组改变的相关性可以指导肿瘤基因组医学中免疫检查点抑制剂治疗的临床决策，并为开发新的治疗靶点提供依据。本工作使用转录组和全基因组测序数据对日本人群中234例肝癌患者进行了免疫基因组分析。大多数肝癌是丙肝病毒（HCV）或乙型肝炎病毒（HBV）阳性，因此在病因上与西方患者不同。本工作发现，根据其免疫抑制机制，将炎症性和非炎症性肝癌被分为两个亚型。发现亚型与病因学、预后、分子亚型和躯体改变有独特的联系。表明了肝癌临床样本中TME的异质性。（1）在之前的工作，对300个肝癌样本进行全基因组测序，对其中的 259 个进行RNA-Seq测序，数据提供在ICGC。其中196个有对应匹配的非癌肝组织数据。表达值进行上四分位标准化（FPKM-UQ）。（2）TCGA的193个肝癌样本的RNA-Seq数据。
（1）通过计算of PRF1和GZMA的表达值（FPKM-UQ）的几何均数来评估溶细胞活性（CYT）。（2）用GenePattern server （https://genepattern.broadinstitute.org/）的单样本GSEA模块来计算特征基因的表达。T细胞、NK细胞、B细胞特征基因来源于Hoshida Y et al的工作，其他特征基因在分子特征数据库（MSigDB, version 6.1）下载。（3）用ESTIMATE R包计算免疫和基质打分。（4）通过输入表达值（FPKM-UQ），用CIBERSORT计算免疫细胞分数。本工作中的234样本使用PCAWG project（https://dcc.icgc.org/pcawg）生成的体细胞突变数据，包括单核苷酸变异（SNVs）、插入（indels）、结构变异（SVs）和拷贝数变异（CNAs）。对JHH4和JHH5这两个HCC细胞系进行分析。使用CRISPR/Cas9敲除基因ARID2。使用Bioconductor “affy” 包使用robust multi-array（RMA）方法对基因表达定量。Bioconductor “limma”包计算基因表达差异Log-fold changes。GenePattern server对 RMA 表达值进行基因集富集分析GSEA。（1）“survMisc”R包进行log-rank 检验（2）对于单一假设检验，显著性阈值为p < 0.05。对于多重假设检验，显著性阈值为BenjaminHochberg校正后FDR < 0.05。为了证实肝癌中炎症性TME有更好的预后，首先比较了肝脏组织的炎症水平和患者的预后。细胞溶解活性（CYT）是一种炎症的测量方法。对肿瘤和其邻近的非瘤组织测CYT，图1表示不同CYT水平（Q1-Q4,CYT升高），患者总生存期和无病生存期的差异。肿瘤CYT水平高的患者的总生存期明显好于肿瘤CYT水平低的患者。肿瘤CYT与年龄、性别和肿瘤分期无关。非肿瘤肝组织CYT与不良预后相关（图1）。这种由非肿瘤性肝组织炎症引起的不良预后可能代表由慢性肝炎和肝硬化引起的肝衰竭或多中心发病。接下来用ESTIMATE免疫评分和 Sia et al.提出的识别免疫类方法进行分析，分别考虑141和112个基因。与肿瘤CYT一致，较高的ESTIMATE免疫评分与较好的总生存率相关。肿瘤的Sia免疫类与总生存期无关。由于CYT与预后的相关性最强，本工作将CYT作为本研究的主要炎症指标。
为了确定影响肿瘤炎症的因素，接下来比较了肝炎组织的炎症（肝癌的主要起因）情况。病毒性肝炎是亚洲肝癌的主要病因之一。经过克鲁斯卡尔-沃利斯检验（Kruskal-Wallis 单因子方差分析）发现，非肿瘤肝组织的CYT与病毒类型显著相关，而肿瘤的CYT与病毒类型不相关。肿瘤CYT与肝纤维化的组织学分期（Inuyama分类）无相关性。肿瘤炎症与病毒、肝纤维化、肝脏炎症的相关性较差，说明TME受肝脏炎症的影响较小。用秩和检验比较肿瘤和非癌组织的CYT，结果显示，与非肿瘤肝组织相比，肿瘤的炎症程度较轻（图2b）。接下来检测了代表性的炎症基因的表达水平（图2a），秩和检验发现T细胞（CD3E、CD8A和CD4）、B细胞（CD19和CD20）和白细胞（CD45）的标志物在肿瘤中的表达水平明显低于非肿瘤肝脏。类似的，干扰素-γ（IFNG）和细胞毒素分子 （GZMA, GZMB, and PRF1）在肿瘤中低表达。免疫应答的多种基因特征在肿瘤中也减少。肿瘤的ESTIMATE 免疫评分要低于非肿瘤组织。CD8 T细胞、NK细胞、B细胞和干扰素应相关的特征基因的表达值在肿瘤中下降（图2c）。非肿瘤性肝组织中B细胞特征的表达增加可能代表慢性丙型肝炎肝内淋巴滤泡的形成。肿瘤中Sia免疫类要低于非瘤肝组织（图2d）。这些结果表明，与非肿瘤性肝相比，肿瘤是免疫静态的。在肝脏癌变过程中，源于肝脏炎症的肝癌可能具有免疫抑制表型。
免疫抑制机制在肝癌的临床样本中是共同作用还是单独作用仍不清楚。接下来使用四组基因表达特征对肝癌进行无监督分级聚类（图3a）。四组特征及基因组成：①调节性T细胞Tregs：FOXP3、IL2RA和CTLA4，T细胞：CD8A 和CD4。②肿瘤相关巨噬细胞TAM:CD163和MRC1。（Tregs和TAM在肝癌中大量存在的基因）③WNT/b-catenin信号（有研究表明WNT/β-catenin信号的激活与T细胞从肿瘤中排除有关）：AXIN2 ④代表抗肿瘤免疫的CYT。使用CIBERSORT估计Treg和TAMs细胞的肿瘤浸润比例，Treg和TAMs与FOXP3和CD163的免疫组化正相关（图3b-h）。WNT/β-catenin信号特征使用的是Chiang DY,et al.定义的基因。234例肝癌肿瘤分成4个免疫亚型（图3a），即TAM、CTNNB1、CYT和Treg亚型，样本数分别为72、45、36和81。TAM和CTNNB1亚型代表非炎症性肿瘤，因为相比于CYT和Treg亚型，TAM和CTNNB1亚型的CYT值低，同时 Sia’s的免疫类比例也低。免疫检查点基因（如PD1和PD-L1）在CYT亚型中表达最高，其次是Treg亚型中。本工作的免疫抑制亚型与基于基因表达的其他分类（如Chiang’s和 Hoshida’s 分类）有一些相似之处（图3a）。TAM和Treg亚型的预后显著差于CTNNB1和CYT亚型（图3i）。在校正了年龄、性别和肿瘤分期后，这种差异仍然显著。由于非炎症性肿瘤通常对免疫检查点治疗具有耐药性，因此这些肿瘤的分子特征可能具有临床意义。在非炎症性的两个亚型，CTNNB1亚型已被广泛研究，而TAM亚型尚未被识别。进一步的对TAM亚型进行了基因集富集分析（GSEA），结果发现TAM亚型中与细胞外基质（ECM）相关的基因表达明显多于与CTNNB1亚型，说明ECM的沉积和重塑增强（图3j）。接下来用TCGA的193个肝癌样本的RNA-Seq数据进行同样的分析。虽然样本在病因上有不同（乙型肝炎病毒和丙肝病毒阴性的患者占TCGA的61%，但在本工作样本中占19%），但TCGA肝癌样本依旧可分为4个亚型（CTNNB1, 25%;CYT, 23%;TAM, 19%;Tregs, 33%）。说明本工作分类方法的稳定性。以上结果表明，根据其免疫抑制机制，炎症性和非炎症性肝癌可以进一步细分。每个亚型都与肝癌的主要临床病理特征有独特的联系。
肿瘤细胞的体细胞基因组改变对肿瘤免疫和TME有相反的影响。体细胞突变产生新抗原并引起细胞毒性T细胞的攻击，而免疫调节基因的体细胞改变促进肿瘤细胞逃避免疫。为了确定体细胞改变和免疫抑制亚型之间的关系，将WGS检测到的体细胞改变与肝癌的免疫信号和亚型进行了比较（图4a）。首先分析了突变负荷，非炎症性CTNNB1亚群的突变负荷高于其他亚群。然后分析了体细胞拷贝数改变（CNAs）的总数，与之前的一项泛癌研究报道所说的“肿瘤非整倍体和免疫细胞浸润之间负相关”的结论一致，在CYT亚型中发现了最低的arm-level CNAs（图4b）。突变负荷和CNA分析显示肝癌与其他类型的癌症相比，炎症具有独特性。接下来研究了个体基因的体细胞改变情况（图4c）。Fisher’s精确检验显示，在肝癌的13个驱动基因中，CTNNB1、ALB和ARID2突变与免疫抑制亚型的相关性有统计学意义。CTNNB1和ALB突变在CTNNB1亚型中显著多。ARID2突变在TAM亚型中显著多。ALB基因编码白蛋白，白蛋白通过隔离免疫抑制的前列腺素E2来促进炎症反应。ARID2基因编码染色质重塑复合物PBAF的一个亚基，该亚基在各种癌症中发生突变。在本工作的肝癌数据中，有17例患者中发现了ARID2的体细胞改变，并与CYT的降低相关。GSEA显示ARID2突变的肿瘤比ARID2野生型肿瘤有更弱的炎症反应和干扰素γ反应。相比之下，ARID2突变的肿瘤中巨噬细胞M2的估计比例明显增加。这些结果说明了肝癌中低度炎症、TAM和ARID2突变之间的三方面关联。
5. 敲除肝癌细胞系中ARID2产生受损的趋化因子接下来分析ARID2在肝癌中的免疫作用。使用敲除ARID2的HCC细胞系（JHH4和JHH5）的基因表达谱，与ARID2野生型细胞表达数据比较，发现16个基因的基因表达水平下降8倍以上，其中有8个是趋化因子（CCL2、CCL20、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL8）。GSEA分析显示，与淋巴细胞和中性粒细胞趋化相关的基因集在ARID2敲除细胞中显著下调（图5b、c）。说明ARID2调控肝癌细胞趋化因子的产生。趋化因子信号受损可能是导致ARID2突变肿瘤炎症减轻的原因。
图5.敲除HCC细胞系中的ARID2可降低细胞因子的mRNA表达本工作对亚洲肝癌样本分析，意图根据肝癌之间的免疫异质性对肝癌免疫微环境进行更细致的分类。首先从预后的角度入手，发现在肝癌样本和非癌样本中，炎症与预后是相反的关系，肝癌样本中高炎症与好预后相关。进一步的分析肝癌样本和非癌样本中炎症和免疫的差异，发现TME受肝脏炎症的影响较小，且肝癌样本免疫程度低。紧接着分析了肝癌中免疫抑制机制，使用四组肝癌相关免疫特征基因表达将样本聚类分析，对炎症性和非炎症性肝癌进一步细分，发现每个亚型都与肝癌的主要临床病理特征有独特的联系。最后对样本的突变及拷贝数分析，发现ARID2能够调控肝癌细胞趋化因子。
