今天跟大家分享的是十月份发表在International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease杂志上慢性阻塞性肺病的一篇文章，影响因子3.274Roundabout signaling pathway involved in thepathogenesis of COPD by integrative bioinformatics analysis综合生物信息学分析参与COPD发病机制涉及的信号通路让我们一起来看一看这篇文章的主要内容，本文主要探讨了慢性阻塞性肺疾病（COPD）发展的潜在机制，并研究环状信号通路在COPD中的作用。首先作者采用生物信息学方法，将三个微阵列数据集（GSE1650，GSE38974和GSE76925）（包括139例严重COPD和52例正常无癌的吸烟者）整合在一起，以筛选差异表达基因（DEG）。然后使用DAVID在线工具将得到的差异基因进行GO和KEGG通路分析。最后，作者建立了香烟烟雾（CS）诱导的肺气肿小鼠模型，使用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测Slit-guidance-ligand 2（SLIT2）-Roundabout（ROBO）信号通路相关基因在肺内的mRNA表达水平并应用免疫组化检测SLIT2蛋白水平。（1）mRNA微阵列芯片数据集：从GEO数据库下载了三个原始的微阵列数据集(GSE1650，GSE38974 和GSE76925 )，该数据集由139名COPD患者和52名健康吸烟者组成。数据的详细信息如表1所示。
（2）筛选DEG并在三个数据集中整合DEG：使用在线工具GEO2R来筛选差异表达基因。（3）PPI网络分析：使用STRING进行PPI网络分析。（4）DEGs的GO和KEGG通路分析：使用DAVID进行通路分析。（6）平均线性截距（Lm）和免疫组织化学染色的定量（7）RNA提取和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）：在此过程中使用的引物如表2所示。
表2.引物信息
作者使用校正的p值<0.05和Fold change> 1.5的阈值来进行差异基因的筛选，在GSE1650数据集中识别出52个DEG（上调37个，下调15个），在GSE38974中识别出4957个DEG（1989年上调和2968个下调）， 在GSE76925中确定了1649个DEG（367个上调和1282个下调）。图1显示了三个数据集中前200个DEG的热图。
在这一部分作者根据三个微阵列数据集的logFC值对DEG进行排序，然后使用RRA方法将其进一步整合。最后鉴定出315个DEG，包括119个上调基因和195个下调基因。表3详细介绍了整合的DEG。然后作者使用R-heatmap软件将前20个上调和下调的基因绘制热图中，如图2所示。
图2. 通过RRA方法筛选的三个微阵列的前20个上调和下调DEG的LogFC热图。
整合DEG的PPI网络如图3所示。与其他基因广泛相互作用的20个hub基因是IL6，CXCL8，MMP9，SNAI1，CYCS，HIF1A，SPP1，THBS1，MMP1，POSTN，CXCL13，CD86，CD19，SDC1，HMOX1，ATM，CX3CR1，GNG13，ANGPTA和TNFRSF （图4）。
表4和5以及图5和6显示了DEGs显著富集的GO结果。
图6. COPD中不同的GO富集的功能中DEG的分布。如图7和表6所示，DEG的KEGG通路分析表明，它们富集在矿物质吸收，细胞因子-细胞因子受体相互作用，轴突指导，癌症中的转录失调，视黄醇代谢和HIF-1信号通路等类别。
在GO富集分析中，作者发现SLIT2和ROBO2基因在Roundabout信号传导通路中富集，并且在严重COPD中这两个基因均被下调。因此，本研究旨在研究SLIT2-ROBO途径在COPD患者所有疾病阶段中的作用。因此，作者下载了GSE38974的表达矩阵。结果显示与吸烟者相比，在COPD的所有阶段，SLIT2和ROBO2的mRNA表达水平均较低（图8A和B），并且与COPD的GOLD阶段均呈负相关（图8D和E）。然而，COPD和吸烟者之间ROBO1表达水平没有统计学差异（图8C和F）。SLIT2和ROBO2的表达水平与年龄和吸烟状况无关（图8G–J）。此外，SLIT2的表达与ROBO2呈正相关，与ROBO1呈正相关（图8K和L）。在COPD中，细胞分裂周期42（Cdc42）和Rac家族小GTPase 2（Rac2）的mRNA表达水平升高，并且两者均与COPD的GOLD期显著正相关（图9A–D）。SLIT2的表达与Cdc42和Rac2呈负相关，而ROBO2的表达与Rac2呈负相关（图9E–H）。
图8. GSE38974中的SLIT2和ROBO表达
图9. GSE38974中的Cdc42和Rac2表达7. 在CS诱导的肺气肿小鼠模型中SLIT2-ROBO信号通路被下调在这一部分，作者建立CS诱导的肺气肿小鼠模型以研究SLIT2-ROBO信号通路是否与肺气肿的发病机制有关。CS诱导小鼠的Lm显著高于对照组（图10A和B），表明肺气肿模型成功建立。与对照相比cs 诱导小鼠的肺中SLIT2和ROBO2的mRNA表达水平均较低（图11A和B）。出乎意料的是，在CS诱导的肺气肿小鼠中，ROBO1的mRNA表达水平也较低（图11C），但是Cdc42和Rac2的RNA表达水平没有统计学差异（图11D和E）。最后，作者使用SLIT2的免疫组化染色来描述SLIT2在肺气肿中的作用。SLIT2蛋白表达在CS诱导的肺气肿小鼠中持续下降，而SLIT2主要在支气管上皮细胞中表达（图10C和D）。此外，SLIT2的平均密度水平与Lm呈负相关（图10E）。
图10. 两组小鼠肺中SLIT2的平均线性截距（Lm）和免疫组织化学染色。
图11.在CS诱导的肺气肿小鼠模型中SLIT2-ROBO信号通路被下调。结论：综合的生物信息学分析可以为COPD的复杂发病机理提供新颖的见解，该研究是第一个提供证据表明Roundabout信号通路可能与COPD发病有关的证据。欢迎关注生信人
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