PacBio Sequel测序与是罗氏（Roche）与PacBio公司共同开发的，在2016年Sequel开始上市，现已逐渐趋于稳定，各大公司及科研单位纷纷采购。而在此时罗氏却宣布与PacBio公司终止合作协议，致使PacBio公司股票跌幅达到43.63%。而罗氏把目标转向新一代的纳米孔测序系统，这背后究竟隐藏着什么？

第三代单分子测序技术分为两大类：

第一类为单分子荧光测序技术，即我们现在市场上的PacBio RSⅡ和PacBio Sequel系统；而第二类为单分子纳米孔测序技术（也称第四代测序技术），目前市场上广泛接受的是 Oxford Nanopore Technologies （ONT）公司的MinION测序仪。

图1 MinION测序仪

MinION纳米孔测序仪的核心是一个有2,048个纳米孔，分成512组，由专用集成电路控制的flow cell。

测序原理见图3所示：

1. 以a-溶血素为材料设计纳米孔，在纳米孔内有共价结 合分子接头的环糊精；

2. 用核酸外切酶切割SSDNA，被切下来的单碱基落入纳米孔中；

3. 单链DNA分子在电场的作用下通过纳米孔，单碱基与纳米孔的环糊精作用（图2a）；

4. 由于纳米孔很小仅允许单个核苷酸聚合物通过，再通过时会短暂影响电流信号，电流信号强度的变化就可以成为我们检测碱基信息的特征（图2c）。

图2 纳米孔测序技术原理

图3 纳米孔测序技术原理

1.高准确度

对于长达1,000个碱基的单链DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜、快速地进行DNA测序成为可能。

2.超长读长

现在给出的纳米孔测序读长在2Kb—300Kb，这个范围看似很大，但纳米孔测序没有测序长度的说法，因为它完全颠覆了测序读长的定义。事实上，它总是能够完整的把一条DNA链从头测到尾，因此它的测序读长就是DNA的长度。极端的情况是，一整条染色体都可以从头测完，但是一般来说样本制备时DNA会断开，所以纳米孔的读长也发生变化。

3.超低价格

纳米孔测序技术根本无需纯化的荧光素试剂，也无需进行DNA扩增，因此不仅省去了试剂的费用，还省去了克隆、扩增的时间，真正做到了省时又省钱。所以花费1,000美元完成二倍体哺乳动物基因组测序这绝不是吹出来的。

4.超小体积

相比Illumina，Pacbio，还是IonProton都是100斤以上大家伙。而MinION纳米孔完全颠覆了测序仪的形象，MinION的尺寸之小，只有一支笔的长度，重大约100克。

1.测序错误率高

纳米孔测序错误率非常高，高达35%的错误率。平均100个碱基，就有35个测序错误。其中3%的插入错误，16%的删除错误，16%的错配。PacBio的三代测序错误率约为15%，因为是随机错误可以通过提高覆盖度进行自身纠错，但纳米孔技术无法像PacBio一样做环形测序，所以目前还没有找到大幅度降低错误率的办法。这也是纳米孔测序技术的致命弱点。

图4 MinION测序仪展示

1.传染病快速筛查

经过研究发现纳米孔测序技术可快速检测致病菌，曾有人使用MinION的快速测序，能够在二十分钟内检测出沙门氏菌。所以纳米孔技术在传染病快速检测方面有明显优势。

2.基因组组装

虽然纳米孔测序的错误率较高，但通过与二代Illumina技术的结合使用，依靠长读长的特点在基因组的复杂区域组装上有很好的效果。

3.碱基修饰信息

纳米孔测序技术可以检测四种胞嘧啶（cytosine）碱基修饰，分别为5-methycytosine，5-hydroxymethycytosine，5-formylcytosine和5-carboxylcytosine。检测准确率为92%-98%。

4.结构变异检测

NGS短序列的特征使结构变异的检测往往不准确。这个问题在癌症的检测中尤其严重，这是因为癌症组织中充斥各种结构变异。研究人员发现利用MinION测得的几百个拷贝的长read得到的结构变异结果比NGS平台测得的上百万read得到的结果更可靠。